واکنش زنچیره پلیمراز PCR

[ebrahimt]

تاریخچه PCR سالها پیش در سال ۱۹۷۱ ، Khorana و همکارانش روشی را برای همانند سازی از یک ناحیه از DNA دو رشته ای را با استفاده از دو پرایمر ساخت DNA گزارش کردند که انتهای ’۳[SUP] [/SUP]پرایمر به سمت یکدیگر طراحی شده بود . ولی ایده استفاده از این خاصیت به صورت چرخه های تکراری در یک واکنش تکثیر تا ۱۲ سال بعد ارائه نشد. ” گاهی یک ایده خوب زمانی به ذهن شما میرسد که انتظارش را نداریم ” این جمله آغازین گزارش karry Mullis ، مخترع PCR در مجله Scientific American است. در مورد اینکه چگونه در هنگام رانندگی درشب در کوههای کارولینای شمالی در بهار ۱۹۸۳ ایده راه اندازی PCR به ذهن وی الهام شد.
polymerase chain reaction یا PCR دستگاه فتوکپی DNA نامیده شده است. اگرچه PCR به نظر ساده می آید ، ولی در واقع یک فرایند پیچیده است که مواد مختلفی در آن نقش دارند. بعضی از مواد در ابتدای واکنش غلظت بسیار کمی دارند (DNA الگو) ولی با پیشرفت واکنش غلظت آنها افزایش می یابد، ولی غلظت برخی از آنها در طول واکنش به میزان بسیار جزئی تغییر می کند (پرایمر و dNTP ) .تغییرات دما و pH زیاد است ،به همین دلیل نوسانات زیادی در واکنشهای دینامیک مولکولی وجود دارد.بنابراین PCR یک فرایند بسیار پیچیده است . ولی کارایی و انعطاف پذیری آن برای کار بر روی DNA بسیار زیاد است.در زمان کوتاهی پس از اختراع آن توسط Kary Mumis ، PCR شناخت ما از زیست شناسی مولکولی را متحول کرده است.ورود PCR در تحقیقات زیست شناسی و پزشکی مثابه یک تقویت کننده در موتور عمل کرده و سرعت پیشرفت تحقیقات بر روی ژنها و ژنومها را افزایش داده است . اکنون ما قادریم که تقریباً هر ژنی را از هر موجودی با PCR جدا کنیم و این روش سنگ بنای تمامی پروژه های تعیین توالی ژنوم می باشد . پس از جدا نمودن یک ژن می توانیم آن را به منظور کلون کردن و یا جهش زائی تغییر دهیم و یا اینکه روشهای تشخیصی برای شناسایی جهشهای آن ژن طراحی کنیم.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PROCESS
PCR یک فرایند آنزیمی در ناحیه مشخصی ار DNA می باشد که بارها و بارها تکرار شده و مقدار بسیار زیادی کپی (محصول) از آن ناحیه مشخص را تولید میکند.
PCR با استفاده از اجزای همانند سازی طبیعی DNA ، در داخل لوله آزمایش DNA را تکثیر می کند. در داخل یک سلول زنده فرایند همانند سازی ژنوم در یک فرایند بسیار پیچیده با دخالت چندین پروتئین مختلف صورت می گیرد. در ساده ترین تعریف برای مراحل همانند سازی ، DNA دو رشته ای از هم باز شده و هر رشته از مولکول اولیه برای ساخت یک رشته مکمل جدید استفاده می شود این مراحل تکثیر بر توانایی نوکلئوتیدها برای جفت شدن با باز مقابل خود بر اساس قوانین معروف واتسون و کریک استوار است ( Aبا T و C با G ) بنابراین رشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.PCR فقط اجزاء اولیه این سیستم پیچیده همانند سازی را جهت تکثیر قطعات کو چک DNA در یک لوله آزمایش به کار می برد.در یک سیستم بافری ساده ناحیه خاصی از مولکول DNA الگو بوسیله یک DNA پلیمراز تکثیر می شود و دی اکسی نوکلئوتیدها بعنوان بلوکهای ساختمانی جهت تولید رشته جدید مورد استفاده قرار می گیرند.پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی اختصاصی که بر اساس قوانین کلی جفت شدن بازها به DNA الگو متصل می شوند ناحیه مورد نظر از DNA الگو را جهت تکثیر مشخص می کنند.رشته DNA الگو با استفده از حرارت از هم جدا میشوند ، حرارت باعث میشود که پیوندهای هیدروژنی بین بازهای رشته های DNA شکسته شود ، که این فرایند تقلیب (Denaturation) نامیده می شود.پرایمر های اولیگونوکلئوتیدی توالیهای مکمل خود را بر روی DNA الگو پیدا خواهند کرد (اتصال annealing) و نهایتاً DNA پلیمراز اضافه کردن دی اکسی نوکلئوتیدها را بر روی عامل ‘OH-3[SUP] [/SUP]پرایمرها آغاز مینماید و مولکولهای جدید از روی هر دو رشته تشکیل میشوند.در مرحله حرارت دهی بعدی این رشته های تازه ساز مجدداً از هم جدا شده و تمامی رشته های جدا شده (هم رشته های اولیه و هم رشته های تازه ساز) جایگاههای اتصال برای پرایمرها فراهم می آورند و بهنوان الگو برای ساخت رشته های DNA بعدی عمل می کنند. و این افزایش مقدار محصول به صورت تصاعدی صورت می گیرد در واقع تعداد رشته های توالی هدف در هر چرخه PCR دو برابر خواهد شد .

یعنی در صورت کارایی ۱۰۰% از هر نسخه DNA موجود درابتدای واکنش ، تنها پس از ۲۰ چرخه از PCR تعداد ۱۰[SUP]۶ [/SUP]نسخه محصول ساخته خواهد شد . البته کارایی واکنش هیچگاه ۱۰۰% نخواهد بود و اغلب به تعداد چرخه های بیشتر بین ۴۰-۲۵ چرخه نیاز می باشد که به مقدار DNA الگوی اولیه و هدف واکنش بستگی دارد . معنی این تکثیر تصادعی این است که اگر واکنش شما بطور اتفاقی با مقادیر بسیار کم از DNA الگو آلوده شود ، ممکن است جوابهای اشتباه بدست آورید.​

 

[ebrahimt]

کاربردهای PCR
1- تشخیص بیماریها: از روش PCR برای بررسی بسیاری از بیماریها استفاده میشود. مثلا در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم (lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام میشود تا تغییر در بیان ژنها بررسی گردد. حساسیت این روش ده هزار برابر روشهای معمول است. PCR را میتوان بمنظور شناسائی میکروارگانیسمهایی بکار برد که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است از جمله میکوباکتریها (mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها (viruses). در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونت زا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده میشود. بدین منظور ژنهای خاصی رهگیری و تعیین مقدار میشوند. بدلیل حساسیت بالای PCR، میتوان بلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسمها را بررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.
2- تحقیقات جنایی (forensic analysis): در صحنه جرم، معمولا مقدار DNA بسیار کم است. بنابر این با روش PCR میتوان تکثیر DNA را انجام داد تا مقادیر کافی از مولکولهای ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی میشود.
3- انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting): با روش PCR میتوان با توجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائی کرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجودات زنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.
4- بررسی DNA قدیمی (ancient DNA): با روش PCR، مولکولهای DNA بسیار قدیمی حتی متعلق به ده ها هزار سال قبل مورد مطالعه قرار گرفته است. مثلا DNA یک ماموت از چهل هزار سال قبل، مومیایی های مصری و تزار روسیه با این تکنیک بررسی شده است.
5- جداسازی DNAی ژنومی: با روش PCR میتوان بخشهایی از DNAی ژنومی را انتخاب و پس از جداسازی تکثیر نمود. مثلا برای کلونینگ DNA و یا تولید شاخصهای دورگه سازی (hybridization probes) در روشهای Southern و Northern، مقادیر زیادی از DNA مورد نیاز است که با روش PCR قابل تهیه است. همجنین در مواردی که حجم نمونه اولیه بسیار کم باشد، با روش PCR میتوان DNAی موجود را تکثیر کرد و سپس مورد مطالعه قرار داد.
6- تعیین توالی DNA (DNA sequencing): پس از تکثیر DNA با روش PCR، میتوان توالی نوکلئوتیدی را تععیین کرد و در صورت لزوم به پلاسمید باکتری یا DNAی کروموزومی در یوکاریوتها الحاق نمود و بدین ترتیب DNAی نوترکیب (recombinant DNA) ایجاد کرد. حتی در مرحله بعد میتوان سریعا با استفاده از PCR، کلنی های باکتری را از نظر وجود این DNAی نوترکیب مورد بررسی قرار داد.

PCR از طریق سرد و گرم کردن کنترل می شوداساس PCR استفاده از دماهای مختلف در سه مرحله واکنش ، تقلیب (denaturation) ، اتصال (annealing) و طویل شدن (extension) میباشد . یک دمای بالا معمولاً ۹۵-۹۴ درجه سانتیگراد برای جدا شدن رشته های DNA الگو بکار برده می شود. سپس دما جهت اتصال پرایمرها به توالی مکمل بر روی رشته الگو پایین آورده می شود که این دما بستگی به پرایمرهای مورد استفاده دارد.نهایتاً برای ساخت DNA با کارایی زیاد ، دما در حد دمای بهینه فعالیت DNA پلیمراز تنظیم می شود . جهت تکثیر DNA هدف لازم است که این دما ، طی چندین چرخه (۴۰-۲۵ چرخه بسته به کاربرد) تکرار شوند. این کار توسط دستگاه ترموسایکلر صورت میگیرد.ترموسایکلر یک دستگاه قابل برنامه ریزی است که میتواند دما را به سرعت تغییر دهد و لوله های آزمایش را در دمای مورد نظر با مدت زمان مشخص نگهداری نماید.قبل از اختراع این دستگاه از سه حمام آب گرم استفاده میشد که هر کدام در یک دمای خاص تنظیم شده بود و لوله های آزمایش در بین حمامها با دست جابجا می شد.

 

[ebrahimt]

[h=2]ترکیبات واکنش PCR[/h]در یک واکنش PCR باید از DNA الگو، آنزیم Taq polymerase ، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب استفاده شود.
DNA الگو
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. نمونه های متنوعی از DNA و RNA بعنوان الگوی PCR قابل استفاده است . این نمونه ها شامل DNA های ژنومی ، m RNA ،c DNA ، خزانه های ژنی ، پلازمید ، فاژ، کاسمید ، و کلونهای BAC ، YAC میباشد . مقدار الگوی مورد نیاز معمولاً از طریق بهینه سازی بدست می آید ولی بطور کلی کمتر از یک نانوگرم از الگوی کلون شده و تا یک میکروگرم از DNA ژنومی استفاده میشود. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل پروتئینها ، چربی ها ، فنل و EDTA، باعث اختلال در عملکرد وهمچنین کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد.آنزیم Taq polymerase
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد.دمای بهینه برای فعالیت این آنزیم در حدود ۷۵-۷۲ درجه سانتیگراد میباشد . با استفاده از این آنزیم میتوان از دماهای بالاتر از ۷۲ درجه نیز در مرحله اتصال پرایمر استفاده نمود که این مزیت باعث دقت بیشتر در شناسایی توالی هدف توسط پرایمرها میگردد و توالی هدف بطور اختصاصی تکثیر می یابد. این آنزیم دارای وزن مولکولی ۹۴ کیلودالتون میباشد که دارای دو خاصیت آنزیمی ’۳ به سمت ’۵ ، DNA پلیمرازی و همچنین فعالیت’۵ به سمت ’۳ اگزونوکلئازی است. این آنزیم دارای طول عمر ۴۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه میباشد که معادل ۵۰ چرخه تحت شرایط عادی PCR است.این آنزیم دارای فعالیت تصحیح اشتباه (proof reading) نیست.به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در ۵۰ میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده (PCR Inhibitor) باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم ۷۲ درجه سانتی گراد می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به فعالیت و تکثیر میباشد لذا برای جلوگیری از اتصال پرایمرها به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.نوکلئوتیدها
چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز ازهر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر ۲۰۰-۵۰ میکرو مولار می باشد. اگر غلظت بالاتر از این حد باشد ، دقت واکنش در جهت عکس کاهش پیدا میکند زیرا در این حالت DNA پلیمراز بازهای اشتباه را در وارد زنجیره میکندو اگر غلظت پایینتر باشد ممکن است بر روی بازده واکنش تاثیر داشته باشد.دستورالعمل ها غلظت ۲۰۰ میکرو مولار از هر یک از d NTP ها را توصیه میکند که این مقذار برای ساخت ۱۰ میکروگرم محصول کافی است.