مهندسی ژنتیک در گیاهان

[آیورودا]

گیاهانی که آفت­کش مورد نیاز خود را می ­سازندگیاهان تقریبا غذای همه انواع موجودات زنده یعنی ویروس­ ها، باکتری­ ها، قارچ­ ها و حیوانات هستند. اما شدیدترین مشکلات در کشاورزی ناشی از حشرات است. برای کاهش خسارت، محصولات کشاورزی به طورمنظم سمپاشی میشوند.اکثر آفت کش­ های سنتی مانند پیرتروئیدها و ارگانوفسفات­ ها تقریبا غیر اختصاصی عمل می­کنند، به طوری که نه فقط حشره ه­ایی که محصولات را از بین می­برد بلکه طیف وسیعی از حشرات را می­کشند. از طرفی این حشره کش­ ها به دلیل سمیت بالایی که دارند برای بسیاری از اعضای زمین از جمله انسان عوارض جانبی را به همراه دارند. همچنین نیازی به سم پاشی بر سطح گیاهان این مشکلات را دوچندان می­کند زیرا در این­صورت ورود این مواد شیمیایی به اکوسیستم خارج از کنترل خواهد بود. علاوه بر این حشراتی که درون گیاهان یا در سطح زیرین برگ گیاهان زندگی می­کنند، گاهی اوقات در امان می­مانند.واضح است که یک آفت­کش ایده آل باید فقط علیه حشره آفت موثر باشد و طوری اختصاصی عمل کند که برای سایر حشرات و حیوانات و انسان سمیت نداشته باشد. همچنین باید بتواند در محیط تجزیه شود و مقداری که پس از برداشت محصول باقی می­ماند و یا در اثر باران به داخل زمین می­رود، نباید به مدت زیادی در محیط باقی بماند و آخر اینکه بهتر است این امکان وجود داشته باشد که آفت­کش به همه­ ی بخش ­های گیاه و نه فقط سطح رویی آن برسد. چنین حشره کش ایده آلی هنوز کشف نشده است. اما نزدیک­ ترین نوع به آن(دلتا اندو توکسین) می­ باشد که بوسیله باکتری باسیلوس تورینژنسیس تولید می­شود.دلتا اندوتوکسین باسیلوس تورینژنسیسحشرات فقط از گیاهان تغذیه نمی­کنند بلکه باکتری­ ها هم گاهی بخشی از رژیم غذایی آنها را تشکیل می­دهند. در مقابل آن بسیاری از باکتری­ ها هم مکانیسم­ های دفاعی را علیه حشرات در خود بوجود آورده­اند. برای مثال باکتری باسیلوس تورینژنسیس در طی اسپورولاسیون خود اجسام کریستالی درون سلولی را تولید می­کند که خاصیت آفت­ کشی دارند و دلتا اندوتوکسین نام دارند. فرم فعال این پروتئین برای حشرات بسیار سمی می­باشد و در بعضی موارد تا ۸۰۰۰۰ بار از بعضی آفت­کش­ ها مثل ارگانوفسفات­ ها سمی ترند و نسبتا اختصاصی عمل می­کنند. سویه­ های مختلف این باکتری پروتئین­ هایی را می­ سازند که علیه لارو گروهای مختلفی از حشرات می­کنند.

 

[آیورودا]

دلتا اندوتوکسینی که در باکتری تجمع می­یابد، یک فرم پیشتاز است. بعد از اینکه این پروتئین توسط حشره هضم شد، توسط پروتئاز برش خورده و پروتئین کوچکتری ایجاد می­شود که خاصیت سمی دارد. این پروتئین به سطح داخلی معده حشره چسبیده و باعث آسیب به سطح اپی تلیومی آن می­شود. در نتیجه حشره قادر به غذا خوردن نمی­باشد و گرسنگی منجر به مرگ حشره می­شود. احتمالا تنوعی که در جایگاه اتصال این سموم در حشرات وجود دارد، باعث اختصاصیت بالای انواع اندوتوکسین­ ها شده است.سم باسیلوس تورینژنسیس کشف جدیدی محسوب نمی­شود، اولین ثبت اختراع برای استفاده از آن به عنوان محافظت از محصولات کشاورزی، به سال ۱۹۰۴ میلادی برمی­گردد. در طی سالیان متمادی، تلاش­های زیادی برای تجاری سازی آن به عنوان آفت­کش دوستدار طبیعت شده است. اما خاصیت زیست تخریب پذیری که دارد محبوبیت آن را کاهش داده است. زیرا باید به طور مکرر در طی رشد محصول استفاده گردد و همین موضوع هزینه کشاورزی را افزایش خواهد داد. بنابراین تحقیقاتی صورت گرفت تا نیازی به استفاده­ ی مکرر آن نباشد. یک روش با استفاده از مهندسی پروتئین بود که ساختار توکسین را طوری تغییر می­داد که پایدارتر شود. یک روش دیگر مهندسی محصولات کشاورزی بود به نحوی که سم توسط خود گیاه تولید شود.کلونینگ ژن دلتا اندوتوکسین در ذرتذرت یکی از محصولاتی است که به خوبی توسط آفت­کش ­های سنتی محافظت نمی­شود. یک آفت مهم، حشره­ ی حفرکننده اروپایی (Ostirinia nubilialis) است که بوسیله تخم­ هایی که در سطح زیرین برگ می­گذارد و درون گیاه ایجاد تونل می­کند، بنابراین آفات از تماس با آفت کش­ های پاشیده شده بر سطح گیاه در امان می­مانند. اولین تلاش برای مقابله با این آفت از طریق مهندسی گیاهان در سال ۱۹۹۳ انجام شد که در اثر آن گیاه قادر خواهد بود خود دلتااندوتوکسین از نوع CryA(b) را بسازد.پروتئین CryA(b) دارای ۱۵۵ اسیدآمینه است که ناحیه­ ای که دارای خاصیت سمی است بین اسیدآمینه­ های ۲۹ تا ۶۰۷ قرار دارد. بنابراین آنها به جای اینکه ژن کامل را کلون کنند، قطعه­ای را ساختند که حاوی ۶۴۸ کدون اول پروتئین بود و آن را وارد ذرت کردند. این تغییراتی که روی ژن انجام دادند، منجر به افزایش بیان ژن در گیاه ذرت شد. بطور مثال از کدون­ هایی در ژن مصنوعی استفاده کردند که توسط گیاه ذرت بیشتر قابل شناسایی بودند و هم­چنین میزان بازهای CG ژن را به ۶۵درصد رساندند. در حالی که میزان CG در ژن اولیه ۳۸درصد بود.این ژن مصنوعی درون یک وکتور کاست بین یک پروموتور و سیگنال پلی­آدنیلاسیون ویروس موزاییک گل کلم قرار داده شد. و بوسیله بمب باران با ریز پرتابه های پوشیده شده با DNA وارد جنین ذرت شد. سپس جنین ذرت را کشت داده تا به گیاه بالغ تبدیل شود و آنگاه با آزمون PCR روی DNA استخراج شده از گیاه و با استفاده از پرایمر ژن مصنوعی ساخته شده و وجود ژن سم در گیاه را تایید کردند.قدم بعدی استفاده از یک آزمون ایمونولوژیک بود تا تشخیص دهیم که دلتااندوتوکسین توسط گیاه ترانسفورم شده تولید می­شود. نتیجه این بود که ژن مصنوعی واقعا فعال است اما میزان سمی که توسط هر گیاه تولید می­شود، متفاوت است و محدوده­ای از ۱۵۰_۲۵۰ نانوگرم از میزان کل پروتئین را شامل می­شود. این تفاوت احتمالا به خاطر اثر موقعیتی بوده، بدین معنا که میزان بیان یک ژن کلون شده در یک گیاه و یا حیوان اکثرا تحت تاثیر جایگاهی قرار دارد که ژن در آن کلون شده است.آیا گیاهان ترانسفورم شده در مقابل حشره حفرکننده اروپایی مقاوم شدند؟ این موضوع با آزمایش گیاهان در مزرعه بررسی شد که در آن گیاهان ترانسفورم شده و گیاهان معمولی را به طور معمولی با لارو آلوده کردند و اثرات تخریبی آن طی شش هفته بررسی شد. ویژگی­های مورد بررسی، میزان تخریب وارد شده به برگ گیاهان آلوده توسط لارو درون گیاه بود. درهر دو مورد گیاه ترانسفورم شده نتیجه­ ی بهتری از گیاه نرمال نشان داده بودند. بالاخص طول تونل در گیاه ترانسفورم شده از ۴۰٫۷cm به ۶٫۳cm کاهش پیدا کرده بود که این نشانه­ ی مقاومت قابل توجه گیاه در برابر لارو است.

کلونینگ ژن دلتا اندوتوکسین در کلروپلاستیکی از مسائل مطرح شده در مورد غلات این بود که شاید ژن­های کلون شده در گیاهان اصلی به علف­ های هرز منتقل شوند. از نظر بیولوژیکی این مساله غیرممکن است زیرا گرده ه­ایی که توسط گیاه اصلی تولید می­شود فقط قادر است تخمک همان­ گونه را بارور سازد، بنابراین انتقال یک ژن از محصول اصلی به گیاه هرز غیر ممکن است. یک دلیل که چنین مساله­ ایی را غیرممکن ساخته است، قرا دادن ژن درون ژنوم کلروپلاست به جای هسته است و به همین خاطر، از آنجا که گرده­ ی گیاهان دارای کلروپلاست نیستند، ژن مورد نظر قادر به جابجایی از گیاه اصلی به علف هرز نمی­باشد.References:Gene Cloning & DNA Analysis (Introduction) by T.A BrownGenomes3 by T.A Brown