دمه تعریف: الکتروفورز نوع دیگری از تکنیکهای جداسازی است که درآن آنالیت ها براساس توانایی و قابلیت حرکت میان یک محیط رسانا، معمولاً یک بافر آبی ، درپاسخ به یک میدان الکتریکی اعمال شده جداسازی می شوند. تکنیک الکتروفورزی که در یک لوله موئین رخ دهد، الکتروفورز موئین نامیده می شود. حوزه کاربرد: CE یک نوع از الکترفورز محلول- آزاد است. قادر به جداسازی گونه -های متنوعی از یونهای معدنی و ترکیبات آلی تا سلولهای دست نخورده با استفاده از یک اسکلت دستگاهی یکسان است که برای جداسازی های مبتنی بر مکانیسم های فیزیکی و شیمیایی متفاوت طراحی شده است. تاریخچه: لوله های موئین از اوخر دهه 1960 بکار برده شدند. در اوائل 1980یورگنسون و لوکاس، این تکنیک را با استفاده از لوله های موئین سیلیکای ذوب شده نازک ( m µ 100 >i.d ) بسط دادند. خصوصیات عمده CE : گستردگی تجزیه ای زیاد، بازده جدا سازی بالا، حساسیت جرمی زیاد، نیاز بی نهایت کم به حجم نمونه ها، زمان های آنالیز کوتاه ( min30t
الکتروفورز
- شروع کننده موضوع chem3
- تاریخ شروع
الکتروفورز دو بعدی
الکتروفورز دو بعدی
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان
شبکه اي متخلخل حركت مي کنند و از يکديگر جدا مي شوند. سير تکوين وتکامل اين روش در جداسازي
پروتئينها ارتباط تنگاتنگي با تلاشهاي انجام شده در بررسي پروتئينهاي سرم دارد.
در سال1937، "Tiselius" روشي براي جداسازي الكتروفورتيك پروتئينهاي سرم ابداع کرد. انگيزه اصلي براي
طراحي اين روش، كه بعدها به الکتروفورز منطقه اي " Zone Electrophoresis" مشهور شد، مشكلاتي بود
كه درحين بررسي پروتئينهاي سرم وجود داشت. "Tiselius" براي اولين بار فراكشن هاي آلفا ، بتا، و گاما
را در سرم تشريح و نام گزاري كرد.
وي به خاطر تحقيق بر روي الكتروفورز و آناليز جذبي، بخصوص اكتشافاتي كه ماهيت پيچيده ي پروتئينهاي
سرم را مشخص مي كرد، جايزه ي نوبل شيمي را در سال 1948 از آن خود کرد.
نقطه ي عطف در توسعة الكتروفورز در دهه هاي 40 و 50 زماني روي داد كه علاوه بر الكتروفورز منطقه اي دو
روش ديگر نيز ظهور كردند:
ايزوالكتروفوكوسينگ ", IEFIsoelectrofocusing" و ايزوتاكوفورزيز " Isotachophoresis".
بنابراين در آن زمان امكان انجام آناليزهاي جداسازي الكتروفورتيك سه گانه بر روي مخلوطهاي پروتئيني يا
بصورت جدا يا در تركيب با همديگر بوجود آمد.
اولين تجارب در جداسازي توسط الکتروفورز دوبعدي به کارهاي Smithies و Poulik در سال 1956 باز ميگردد
که با بکار بردنِ ترکيبي از الکتروفورز بر روي کاغذ و بر روي ژل نشاسته پروتئين هاي سرم را جداو تفکيک
کردند.
پيشرفتهاي بعدي در فناوري الکتروفورز، نظير استفاده از پلي آکريل آميد و استفاده از شيبهاي غلظتي
پلي آکريل آميد، به سرعت در جداسازي هاي دو بعدي به کار گرفته شد. به خصوص استفاده از"IEF" در
جداسازي دو بعدي اين امر را امکان پذير ساخت که جداسازي بُعد اول بر پايه خصوصيات بار الکتريکي
پروتين ها صورت پذيرد. در سال 1970 الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد به همراه سديم دو دسيل سولفات
" Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE" توسط "Laemmli"
معرفي شد.
ترکيب "IEF" با "SDS-PAGE" در بُعد دوم منجر به ابداع روشي گشت که پروتئين ها را بر پايه دوعامل متفاوت
يعني بار الکتريکي و جرم مولکولي از يکديگر جدا مي ساخت. اين روش برای انواع متفاوتي از نمونه ها با
خواص حل پذيری متفاوت انطباق يافت؛ بدين معني که استفاده از اوره و دترجنت های غيريونی در "IEF"،
امکان محلول سازي نمونه هاي متفاوت را فراهم نمود. بدين ترتيب تا سال 1975 يک سيستم الکتروفورز
دوبعدي تکامل يافت که مي توانست برای آناليز مخلوط های پروتئينی بدست آمده از کلِ يک سلول يا
بافت ها بکار گرفته شود.
براساس اين پيشرفتها "O’Farrell" درسال 1975 روش الکتروفورز دوبعدي را که برای جداسازی پروتئينهای
"E.coli" بهينه شده بود، گزارش کرد.
او در اين روش از ايزوالکتروفوکوسينگ در ژلهای پلی آکريل آميد استوانه ای که حاوی 8% اوره و 2% "NP40"
بود، در ترکيب با"SDS-PAGE" ناپيوسته ي"Laemmli" استفاده کرد.
ترکيب جداسازی بر پايه بارالکتريکی (نقطه ايزوالکتريک ياpI) وجداسازی براساس اندازه (جرم مولکولی نسبی
يا Mr ) باعث مي شود که پروتئين های نمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزيع شوند. اين شگرد اساس پيشرفت و
تکامل الکتروفورز دوبعدي را در 30 سال بعدی تشکيل داد به طوری که تا کنون هزاران مقاله با استفاده از
آن انتشار يافته است.
روشهاي آماده سازي نمونه
قدم اول در آماده سازي نمونه, استخراج پروتئين ها از منبع مورد نظر است. ممکن است استخراج پروتئين ها
مستقيما" توسط بافر محلول سازي "Solubilization buffer" صورت پذيرد. ممکن است اين عمل توسط روش
هاي متلاشي ساختن سلولها "Cell disruption" و بافتها انجام شود و سپس پروتئين هاي استخراج شده
در بافر محلول سازي کاملا" حل شوند. براي استخراج كامل پروتئينهاي داخل سلولي، سلول بايد کاملا"
متلاشي شود. انتخاب روش متلاشي سازي بستگي به اين دارد كه نمونه از چه منبع بيولوژيکي, از سلول,
بافت جامد و يا از منابع ديگري, بدست آمده باشد. بعد از استخراج, اين نمونه ها بايد براي انجام الکتروفورز
دوبعدي آماده شوند. منظور از آماده سازي نمونه, محلول ساختن حداکثر پروتئين هاي موجود و حفظ
حلاليت آنها در حين روند الکتروفورز دو بعدي است.
هيچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هايی که توسط الکتروفورز دو بعدي
مورد بررسی قرار مي گيرند, معرفي کرد. در واقع ماهيت متفاوت نمونه ها امکان بکار گيري روشي يکسان
را در آماده ساختن آنها براي الکتروفورز دو بعدي منتفي مي سازد. از طرفي ديگر، روش بکار گرفته شده در
هر تجربه اي به هدف طراحي شده نيز بستگي دارد. براي مثال, ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دو
بعدي دستيابي به پروتئينهايي با ويژگي هاي خاص باشد يا ممکن است دستيابي به نقشه کامل از پروتينهاي
نمونه از اهميت بيشتري برخوردار باشد, در هر يک از اين موارد استراتژي هاي انتخابي کاملا" متفاوت
خواهند بود.
در بهينه ساختن استراتژي آماده سازي نمونه بايد از نتايج موردنظر, انتظاري مشخص داشت؛ بايد براي ما
مشخص باشد که نشان دادن نمونه بطور كامل مهمتر است يا بدست آوردن يك الگوي تكرارپذير.
اضافه تر کردن مراحل آماده سازي نمونه مي تواند كيفيت نتيجه نهايي را بهتر کند, اما اين امر به قيمت از
دست دادن گروهي از پروتئينها تمام مي شود. به هرحال, اين تناقص و نسبت معکوس بين كيفيت نمونه
بهبود يافته و نمونه سازي كامل پروتئينها بايد کاملا"درنظر گرفته شود.
در هر صورت, خطوط راهنماي کلي براي آماده سازي نمونه وجود دارد که با پي گيري آنها مي توان قدمهاي
نخست را در اين راه به درستي برداشت و سپس با تجربه بهترين نتيجه را بدست آورد.
مباني الکتروفورز
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان
شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان
است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند.
به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا"
الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما
در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي
يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را
درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل
در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع
به حرکت مي کنند.
اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي
مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر
گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز
و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها
را نيز ايفا مي کند.
در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه
در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد.
جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و
اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و
حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.
1- اثر عوامل الکتريکي
در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم
Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 1)
V=IR
معادله 1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت
بر حسب اُهم است
معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در
حين الکتروفورز را مشخص مي کند.
P=V2/R يا P=I2R يا P=VI
معادله 2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.
اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول
Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم
مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند.
بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت.
براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر
الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش
يابد .
براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به
سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.
انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت ميپذيرد.
براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن
فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز.
معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت
انجام مي شود.
اثر سيستم هاي بافري و pH
پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص
خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH محلول هاي مورد استفاده ثابت
باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H+" و در کاتود يونهاي "OH-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه
داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.
2- اثر حرارت
براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه
شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد
ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا"
مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات
ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه.
وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم » شود و در اصطلاح
باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.
الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد
اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي
يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي روي ژل پلي آكريل آميد تحت
عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور
همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.
اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان
الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل
مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.
درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving ژل رديف
کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد.
در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.
اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه
را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک
کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.
مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري
تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع
مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.
رديف شدن ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك
كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور
مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند.
يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه يك ناحية باريك
يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است پروتئين ها را بصورت باندي
باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن
محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير
است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين )
متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه
در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.
نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت
ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .
ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع Cross linker,
بيس آکريل آميد شكل مي گيرند.
پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine
(TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.
راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده
و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي توان
د در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات
براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.
اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است.
اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد
کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.
بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در
غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش
نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد
براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است.
محدوده اندازه ي مولکولي قابل تفکيک (kD) درصد آکريل آميد در ژل:
205-36 5%
205-24 5/7%
205-14 10%
66-14 12%
45-14 15%
((در صد آکريل آميد براي جداساژط پروتئين هايي با اندازه هاي مختلف))
نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان
پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون
مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار ميدهند
نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند.
براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به
پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار
منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب
تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.
الکتروفورز دو بعدی
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان
شبکه اي متخلخل حركت مي کنند و از يکديگر جدا مي شوند. سير تکوين وتکامل اين روش در جداسازي
پروتئينها ارتباط تنگاتنگي با تلاشهاي انجام شده در بررسي پروتئينهاي سرم دارد.
در سال1937، "Tiselius" روشي براي جداسازي الكتروفورتيك پروتئينهاي سرم ابداع کرد. انگيزه اصلي براي
طراحي اين روش، كه بعدها به الکتروفورز منطقه اي " Zone Electrophoresis" مشهور شد، مشكلاتي بود
كه درحين بررسي پروتئينهاي سرم وجود داشت. "Tiselius" براي اولين بار فراكشن هاي آلفا ، بتا، و گاما
را در سرم تشريح و نام گزاري كرد.
وي به خاطر تحقيق بر روي الكتروفورز و آناليز جذبي، بخصوص اكتشافاتي كه ماهيت پيچيده ي پروتئينهاي
سرم را مشخص مي كرد، جايزه ي نوبل شيمي را در سال 1948 از آن خود کرد.
نقطه ي عطف در توسعة الكتروفورز در دهه هاي 40 و 50 زماني روي داد كه علاوه بر الكتروفورز منطقه اي دو
روش ديگر نيز ظهور كردند:
ايزوالكتروفوكوسينگ ", IEFIsoelectrofocusing" و ايزوتاكوفورزيز " Isotachophoresis".
بنابراين در آن زمان امكان انجام آناليزهاي جداسازي الكتروفورتيك سه گانه بر روي مخلوطهاي پروتئيني يا
بصورت جدا يا در تركيب با همديگر بوجود آمد.
اولين تجارب در جداسازي توسط الکتروفورز دوبعدي به کارهاي Smithies و Poulik در سال 1956 باز ميگردد
که با بکار بردنِ ترکيبي از الکتروفورز بر روي کاغذ و بر روي ژل نشاسته پروتئين هاي سرم را جداو تفکيک
کردند.
پيشرفتهاي بعدي در فناوري الکتروفورز، نظير استفاده از پلي آکريل آميد و استفاده از شيبهاي غلظتي
پلي آکريل آميد، به سرعت در جداسازي هاي دو بعدي به کار گرفته شد. به خصوص استفاده از"IEF" در
جداسازي دو بعدي اين امر را امکان پذير ساخت که جداسازي بُعد اول بر پايه خصوصيات بار الکتريکي
پروتين ها صورت پذيرد. در سال 1970 الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد به همراه سديم دو دسيل سولفات
" Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE" توسط "Laemmli"
معرفي شد.
ترکيب "IEF" با "SDS-PAGE" در بُعد دوم منجر به ابداع روشي گشت که پروتئين ها را بر پايه دوعامل متفاوت
يعني بار الکتريکي و جرم مولکولي از يکديگر جدا مي ساخت. اين روش برای انواع متفاوتي از نمونه ها با
خواص حل پذيری متفاوت انطباق يافت؛ بدين معني که استفاده از اوره و دترجنت های غيريونی در "IEF"،
امکان محلول سازي نمونه هاي متفاوت را فراهم نمود. بدين ترتيب تا سال 1975 يک سيستم الکتروفورز
دوبعدي تکامل يافت که مي توانست برای آناليز مخلوط های پروتئينی بدست آمده از کلِ يک سلول يا
بافت ها بکار گرفته شود.
براساس اين پيشرفتها "O’Farrell" درسال 1975 روش الکتروفورز دوبعدي را که برای جداسازی پروتئينهای
"E.coli" بهينه شده بود، گزارش کرد.
او در اين روش از ايزوالکتروفوکوسينگ در ژلهای پلی آکريل آميد استوانه ای که حاوی 8% اوره و 2% "NP40"
بود، در ترکيب با"SDS-PAGE" ناپيوسته ي"Laemmli" استفاده کرد.
ترکيب جداسازی بر پايه بارالکتريکی (نقطه ايزوالکتريک ياpI) وجداسازی براساس اندازه (جرم مولکولی نسبی
يا Mr ) باعث مي شود که پروتئين های نمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزيع شوند. اين شگرد اساس پيشرفت و
تکامل الکتروفورز دوبعدي را در 30 سال بعدی تشکيل داد به طوری که تا کنون هزاران مقاله با استفاده از
آن انتشار يافته است.
روشهاي آماده سازي نمونه
قدم اول در آماده سازي نمونه, استخراج پروتئين ها از منبع مورد نظر است. ممکن است استخراج پروتئين ها
مستقيما" توسط بافر محلول سازي "Solubilization buffer" صورت پذيرد. ممکن است اين عمل توسط روش
هاي متلاشي ساختن سلولها "Cell disruption" و بافتها انجام شود و سپس پروتئين هاي استخراج شده
در بافر محلول سازي کاملا" حل شوند. براي استخراج كامل پروتئينهاي داخل سلولي، سلول بايد کاملا"
متلاشي شود. انتخاب روش متلاشي سازي بستگي به اين دارد كه نمونه از چه منبع بيولوژيکي, از سلول,
بافت جامد و يا از منابع ديگري, بدست آمده باشد. بعد از استخراج, اين نمونه ها بايد براي انجام الکتروفورز
دوبعدي آماده شوند. منظور از آماده سازي نمونه, محلول ساختن حداکثر پروتئين هاي موجود و حفظ
حلاليت آنها در حين روند الکتروفورز دو بعدي است.
هيچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هايی که توسط الکتروفورز دو بعدي
مورد بررسی قرار مي گيرند, معرفي کرد. در واقع ماهيت متفاوت نمونه ها امکان بکار گيري روشي يکسان
را در آماده ساختن آنها براي الکتروفورز دو بعدي منتفي مي سازد. از طرفي ديگر، روش بکار گرفته شده در
هر تجربه اي به هدف طراحي شده نيز بستگي دارد. براي مثال, ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دو
بعدي دستيابي به پروتئينهايي با ويژگي هاي خاص باشد يا ممکن است دستيابي به نقشه کامل از پروتينهاي
نمونه از اهميت بيشتري برخوردار باشد, در هر يک از اين موارد استراتژي هاي انتخابي کاملا" متفاوت
خواهند بود.
در بهينه ساختن استراتژي آماده سازي نمونه بايد از نتايج موردنظر, انتظاري مشخص داشت؛ بايد براي ما
مشخص باشد که نشان دادن نمونه بطور كامل مهمتر است يا بدست آوردن يك الگوي تكرارپذير.
اضافه تر کردن مراحل آماده سازي نمونه مي تواند كيفيت نتيجه نهايي را بهتر کند, اما اين امر به قيمت از
دست دادن گروهي از پروتئينها تمام مي شود. به هرحال, اين تناقص و نسبت معکوس بين كيفيت نمونه
بهبود يافته و نمونه سازي كامل پروتئينها بايد کاملا"درنظر گرفته شود.
در هر صورت, خطوط راهنماي کلي براي آماده سازي نمونه وجود دارد که با پي گيري آنها مي توان قدمهاي
نخست را در اين راه به درستي برداشت و سپس با تجربه بهترين نتيجه را بدست آورد.
مباني الکتروفورز
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان
شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان
است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند.
به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا"
الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما
در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي
يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را
درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل
در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع
به حرکت مي کنند.
اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي
مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر
گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز
و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها
را نيز ايفا مي کند.
در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه
در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد.
جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و
اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و
حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.
1- اثر عوامل الکتريکي
در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم
Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 1)
V=IR
معادله 1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت
بر حسب اُهم است
معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در
حين الکتروفورز را مشخص مي کند.
P=V2/R يا P=I2R يا P=VI
معادله 2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.
اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول
Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم
مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند.
بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت.
براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر
الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش
يابد .
براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به
سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.
انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت ميپذيرد.
براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن
فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز.
معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت
انجام مي شود.
اثر سيستم هاي بافري و pH
پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص
خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH محلول هاي مورد استفاده ثابت
باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H+" و در کاتود يونهاي "OH-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه
داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.
2- اثر حرارت
براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه
شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد
ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا"
مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات
ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه.
وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم » شود و در اصطلاح
باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.
الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد
اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي
يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي روي ژل پلي آكريل آميد تحت
عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور
همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.
اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان
الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل
مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.
درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving ژل رديف
کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد.
در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.
اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه
را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک
کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.
مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري
تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع
مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.
رديف شدن ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك
كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور
مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند.
يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه يك ناحية باريك
يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است پروتئين ها را بصورت باندي
باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن
محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير
است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين )
متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه
در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.
نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت
ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .
ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع Cross linker,
بيس آکريل آميد شكل مي گيرند.
پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine
(TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.
راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده
و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي توان
د در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات
براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.
اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است.
اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد
کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.
بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در
غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش
نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد
براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است.
محدوده اندازه ي مولکولي قابل تفکيک (kD) درصد آکريل آميد در ژل:
205-36 5%
205-24 5/7%
205-14 10%
66-14 12%
45-14 15%
((در صد آکريل آميد براي جداساژط پروتئين هايي با اندازه هاي مختلف))
نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان
پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون
مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار ميدهند
نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند.
براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به
پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار
منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب
تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.
آخرین ویرایش:
SDS-PAGE پروتئینها:
سدیم دودسیل سولفات”SDS” یک دترجنت آنیونی است که به اغلب مولکولهای پروتئینی در
محلول های مایی و در pH های متفاوت متصل می شود. “SDS” تقریبا” به همه ی پروتئینها
با نسبت تقریبی ۴/۱ گرم در ۱ گرم پروتین اتصال می یابد. برای همین “SDS” باعث القاء بار
الکتریکی منفی متناسب با اندازه در پلی پپتیدها میگردد. علاوه بر این “SDS” با تخریب پیوند
های هیدروژنی و بر هم کنش های هیدروفوبی, باعث تخریب ساختمان دوم و سوم پروتئین
ها می گردد.
در صورت حضور یک ماده ی احیا کننده نظیر “DTT” پیوندهای دی سولفیدی از گسسته و تا-
خوردگی پروتئین ها به طور کامل از بین می رود. پلی پپتیدهایی که شکل طبیعیشان توسط
“SDS” برهم خورده و احیا هم شده اند بشکل میله هایی انعطاف پذیر در می آیند که دارای
بار منفی یک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتریکی به جرم مولکولی
در این پلی پپتیدها تقریبا” نسبتی مشابه است, جداسازی پروتئینها در الکتروفورز تحت چنین
شرایطی تقریبا” به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولی آنها است.برخی پروتئین ها در
“SDS-PAGE” رفتاری غیرعادی دارند به خصوص برخی گلیکوپروتئین ها به مقادیر عادی از“SDS”
متصل نمی شوند, در نتیجه نسبت بار الکتریکی به وزن مولکولی در آنها مشابه این نسبت در
پروتئینهای دیگر نیست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتیجه وزن مولکولی بیشتری از خود نشان
خواهند داد.
پروتئین هایی با بارمنفی زیاد و یا با بار مثبت زیاد, مثلا” هیستون ها, یا پروتئینهای غنی از پرولین,
مثلا” کلاژن, در مجاورت “SDS” بطور غیرطبیعی وزن مولکولی بالایی از خود نشان می دهند.
به هرحال، “SDS-PAGE” در جداسازی پروتئینهایی با جرم مولکولی خیلی مشابه که دارای تغییرات
بعد از ترجمه, نظیر استیلیشن یا متیلیشن یا فسفروریلیشن, هستند از ارزش کمی برخوردار
است. برای آنالیز چنین پروتئین های تغییر یافته ای، از روش PAGE با اوریک اسید استفاده میشود
که در آن هم وزن مولکولی و هم بار پروتئین در فرآیند جداسازی دخیل است .
پروتئین در pH اسیدی بار مثبت دارد و در میدان الکتریکی به سمت کاتد حرکت می کند . به این
دلیل از روش PAGE اسیداوره عموماً برای جداسازی پروتئین هایی با سایز یکسان و بار متفاوت
استفاده می شود.مشکلاتی که ممکن است درحین آماده سازی و کار با ژل SDS بوجود آید:
مشکل | علت | چاره کار |
کاهش میزان پلیمریزاسیون ژل | وجود اکسیژن ، کهنه بودن محلولهای استوک بخصوص آکریل آمید و امونیوم پرسولفات | محلولها را degas کنید. مجدداً محلول استوک تهیه کنید . |
تشکیل انتهای چسبنده ژل | نفوذ n-butanol به ژل. | محلول ژل را با n- بوتانل بپوشانید بدون اینکه مخلوطشان کنید . |
نارضایتی از نتیجه رنگ آمیزی، رنگ آمیزی ضعیف | رنگ بطور مطلوب باند با نمونه نشده است | از محلول غلیظ تر رنگ استفاده کنید . زمان رنگ‌آمیزی را افزایش دهید و یا از رنگی با حساسیت بالا استفاده کنید. محلول رنگی می بایستی حاوی محلول ارگانیک ( مثل متانول ) باشد که SDS را از پروتئین جدا کند چراکه ممکن است رنگ به آن بچسبد . |
رنگ یکدست نیست | نفوذ رنگ و یا رنگ بری بصورت یکدست انجام نشده است . | ژل را درطی رنگ آمیزی و رنگ بری تکان دهید . زمان رنگ آمیزی و رنگ بری را افزایش دهید . |
باندها رنگ نگرفته اند . | رنگ پروتئین حذف شده است. | ژل را مجدداً رنگ کنید . زمان رنگ بری را کم کنید و یا از رنگی استفاده کنید که پروتئین را طوری رنگ کند که رنگش محو نشود .. |
بر روی ژل نشانه هایی از رنگ در نواحی غیراختصاصی مشاهده می شود | درمحلول رنگی ، رنگ به صورت جامد و حل نشده باقی مانده و مشاهده می شود . | از حل شدن کامل رنگ اطمینان حاصل کرده یا اینکه رنگ را پیش از استفاده ***** کنید . |
آلودگی بطور وضوح مشاهده می شود . | وسایل و یا محلولهای استوک آلوده هستند . مواد غیرپروتئینی در نمونه رنگ گرفته اند به عنوان مثال اسیدنوکلئیک | وسایل را تمیز کرده یا از وسایل نو استفاده کنید. از رنگ دیگری استفاده کنید که آلودگی ها را رنگ ننماید . |
تفکیک باندهای پروتئینی بخوبی انجام نگرفته است . | الکتروفورز ناکارآمد . سایز حفره ژل جداکننده مناسب نیست . میزان load شده تا میزان زیادی عوض شده است | درصد C و T ژل جداکننده را تغییر دهید . هربار از میزان Loading یکسانی استفاده کنید . |
هر از گاهی تغییرات جزئی درحرکت الکتروفورتیک پروتئینهای استاندارد مشاهده می شود . | اجزاء سازنده ژل به لحاظ کیفی از Batch به Batch دیگر با گذشت زمان تغییر می کند . | از یک Batch ماده شیمیایی تا حداکثر زمان ممکن استفاده کنید و محلولهای Stock دترجنت های کهنه را عوض کنید . |
کج و معوج شدن باندها ، باندها پخش یا رگه دار شده باشد . | پروتئینهای نمونه در حلال غیرقابل حلند، یا بصورت مجتمع aggregate باقی مانده اند . یک عامل حل نشده است یا حباب موجود در ژل با باند پروتئینی درحال حرکت درگیر شده است . | از حلال تازه با SDS اضافی و عوامل کاهنده استفاده کنید بخصوص برای محلولهای مربوط به نمونه تغلیظ شده . محلول Stock را پیش از استفاده ***** کنید و هرگونه حبابی را از ژل خارج کنید . |
مهاجرت پروتئینی یکپارچه نیست ( باندها خم می شوند ( | سایز حفرات ژل یکسان نیست . بخشی از ژل درگیر نشده است . نشت الکتریکی (برق دزدی) خنک کردن ژل یکپارچه نیست ( در نتیجه یک بخش سریعتر از بخش دیگر حرکت می کند (. | مطمئن شوید که محلولهای ژلی بخوبی مخلوط شده اند و پلیمریزاسیون خیلی به سرعت انجام گرفته ( برای کاهش زمان پلیمریزاسیون پرسولفات را کاهش دهید .( قبل از الکتروفورز هر حبابی را که به ژل چسبیده حذف کنید . مطمئن شوید که اسپیسهای کناری درجای مناسب قرارگرفته اند . سیستم خنک کننده ژل را بهبود بخشید یا میزان گرما را با کاهش ولتاژ یا قدرت یونی بافر کاهش دهید . |
روش های آشکارسازی پروتئینها بر روی ژل های دو بعدی :
روشهای آشکارسازی پروتئینها بر روی ژلهای دوبعدی را می توان به ۵ نوع اساسی تقسیم کرد:
- رنگ آمیزی با رنگهای آنیونیک نظیر کوماسی بلو
- رنگ آمیزی منفی با کاتیونهای فلزی مثل رنگ آمیزی زینک یا روی
- رنگ آمیزی Silver یا نقره
- فلورسانس
- ایزوتوپهای رادیواکتیو با استفاده از اتورادیوگرافی ، فلوروگرافی یا فسفرو ایمیجینگ
در اغلب این روشهای رنگ آمیزی پلی پپتید های تفکیک شده باید حداقل چند ساعت درمحلولی
حاوی اتانول, استیک اسید و آب تثبیت شوند.
رنگ آمیزی آبی کوماسی و ایمیدازول
روش انتخابی برای رنگ آمیزی ژل پس از انجام ۲D-PAGE بستگی به طبیعت نمونه اولیه و هدف
آزمایش دارد.
برای شناسایی پروتئین ها با استفاده از ژل های Preparative و طیف سنجی جرمی یک روش
رنگ آمیزی قابل برگشت مورد نیاز است.
رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با آبی کوماسی یا ایمیدازول – روی نتایج مطلوبی بدست میدهد
که با روشهای طیف سنجی جرمی سازگار استآبی کوماسی اساساً اولین بار برای رنگ آمیزی
اسیدی پشم تهیه شد. دو گونه ی مختلف از این رنگ وجود دارد که به نامهای آبی کوماسی G-۲۵۰
و R-۲۵۰ شناخته می شوند و به ترتیب دارای ته رنگ سبز و قرمز هستند. عدد ۲۵۰ نیز معرف
قدرت رنگ است که اولین بار توسط تولید کنندة آن Imperial Chemical Industries مورد استفاه
قرارگرفت. اگر چه این شرکت دیگر رنگ را تولید نمی کند ولی علامت تجاری این محصول به آن
تعلق دارد. روش رنگ آمیزی رایج ژلهای پلی آکریل آمید با آبی کوماسی که در ترکیب با اسید
استیک و متانل بکار می رود، سالهاست که مورد استفاده قرار می گیرد. رنگ کوماسی آبی
G-۲۵۰ با اسیدهای آمینه قلیایی از جمله آرژی نین، تیروزین، لیزین و هیستیدین ایجاد کمپلکس
می کند. اما رنگ شدید زمینه و متعاقب آن نیاز به مراحل متعدد رنگ زدایی از نکات منفی این
روش است.
روش رنگ آمیزی ایمیدازول – روی که توسط Ortiz و همکارانش ابداع شد یک روش رنگ آمیزی
نگاتیو است که در آن زمینه ی ژل به جای پروتئین ها رنگ می شود. در این روش در مناطقی
از ژل که حاوی پروتئین نیستند, کمپلکسی از “SDS” و ایمیدازول روی رسوب میکنند, که یک
زمینه ی سفید کدر روی ژل ایجاد می کند. مناطقی از ژل که حاوی پروتئین هستند شفاف
باقی می مانند. این روش رنگ آمیزی به حساسیت روش نقره است و تنها نیم ساعت طول
می کشد. علاوه بر این ، نیازی به تثبیت پروتئین ها در ژل وجود ندارد. برهم کنشی بین رنگ
و پروتئین وجود ندارد ودر صورت نیاز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدایی کرد. در اینجا هر دو روش
شرح داده می شود .
این روشها را برای ژلهای ۲-D آنالیتیکال و ژلهای SDS-PAGE هم میتوان بکار برد. برای ژلهای
نازک تر ( کمتر از یک میلی متر ) زمان انکوباسیون در روش ایمیدازول- روی را میتوان کاهش
داد.همة محلولها باید در ظروف شیشه ای و با آب مقطر دیونیزه تهیه شوند. محلولهای رنگ
آمیزی آبی کوماسی G-۲۵۰ عبارتند از محلول تثبیت کننده و محلول رنگ آبی کوماسی G-۲۵۰.
محلول های روش رنگ آمیزی منفی ایمیدازول-روی عبارتند از محلول کربنات سدیم، محلول
ایمیدازول SDS ،محلول استات روی. هرگونه ذرات معلق باید توسط کاغذ ***** Whatman
شماره ۱ صاف شود. در این روش ها تمام محلول ها و ژلها باید با دستکش کار شوند و تمام
مراحل کار در دمای اتاق و در ظروف رنگ آمیزی و روی شیکر انجام شود.
در روش رنگ آمیزی با آبی کوماسی G-۲۵۰, تثبیت ژل بلافاصله پس از الکتروفورز انجام میشود.
با این وجود باید توجه داشت که مرحله تثبیت کردن در این روش رنگ آمیزی یک ضرورت نیست.
مرحله تثبیت ژل در روش ایمیدازول-روی ضروری نیست و ژلها بلافاصله پس از الکتروفورز رنگ
آمیزی می شوند.
برای مشاهده ی بهتر، رنگ آمیزی ژل در یک زمینه تیره برای تشخیص نحوه ی ظهور رنگ ایده
آل خواهد بود. هنگامی که وضوح مطلوب بر روی ژل مشاهده شد پروتئین ها بصورت مناطق
شفاف در یک زمینة مات سفید خود را نشان می دهند.
نکته ها :
- رنگ آمیزی با آبی کوماسی R-۲۵۰ با روشهای طیف سنجی جرمی سازگاراست.
- تفاوتهایی در حساسیت و زمان رنگ آمیزی روشهای شرح داده شدة فوق وجود دارد.
تجربه نشان داده است که حساسیت روش رنگ آمیزی ایمیدازول روی به اندازة روش
نقره است (۱۰-۱ نانوگرم BSA ) و حدود نیم ساعت طول می کشد. در بین روشهای
فوق ، روش رنگ آمیزی منفی از همه سریعتر و حساستر است. اما این ژلها اندکی
شکننده تر بنظر می رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن
هستند.
ضمناً برای مشاهده نیاز به زمینة تیره دارند. روش استاندارد کوماسی R-۲۵۰ از بقیه
حساسیت کمتری دارد و الکل زیادی نیز مصرف می کند.
فوق ، روش رنگ آمیزی منفی از همه سریعتر و حساستر است. اما این ژلها اندکی
شکننده تر بنظر می رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن
هستند.
ضمناً برای مشاهده نیاز به زمینة تیره دارند. روش استاندارد کوماسی R-۲۵۰ از بقیه
حساسیت کمتری دارد و الکل زیادی نیز مصرف می کند.
- اگر با ژل ها با ملایمت رفتار نشود ترک می خورند و می شکنند. اگر چنین اتفاقاتی
برای ژل زیاد روی می دهد اکریل آمید را با دورآکریل جایگزین کنید.
- ظرف رنگ آمیزی باید به گونه ای انتخاب شود که اندکی بزرگتر از ژل باشد. ژلها بویژه
ژلهای بزرگ، باید در ظروف جداگانه رنگ آمیزی شوند. ظروف پلاستیکی مناسب برای
رنگ آمیزی ارجحیت دارند اما ظروف شیشه ای نیز مناسب هستند .
رنگ آمیزی ارجحیت دارند اما ظروف شیشه ای نیز مناسب هستند .
- طیف سنجی پپتیدی و طیف مربوط به ترادف پپتیدها را با کیفیت خوبی می توان از
پروتئین بدست آمده از یک الی چهار نقطه بدست آمده از ژلهای مشابهی که با هر
کدام از روشهای رنگ آمیزی گفته شده در این بخش رنگ شده باشند بدست آورد.
آبی کوماسی را میتوان در طی هضم داخل ژل توسط تریپسین، با کمک حلال های
آلی از بین برد.
تکه ژلهایی که توسط ایمیدازول- روی رنگ آمیزی شده اند را می توان پیش از قرار
دادن در معرض تریپسین، توسط اسید سیتریک ۲% رنگ زدایی کرد. البته این کار
ضروری نیست . باید توجه نمود که رنگ آمیزی نقره نیز با اعمال تغییراتی می تواند
با طیف سنجی جرمی سازگار شوند.
در سال ۱۹۸۵ Neuhoff روشی حساس برای رنگ آمیزی پروتئین در ژلهای آکریلامید بر پایة
ویژگی کلوئیدی آبی کوماسی G-۲۵۰ ارائه کرد. این روش درکمتر از یک ساعت پروتئین ها
را در یک زمینه تمیز و با حساسیتی درحدود روش نقره رنگ آمیزی می کند. این روش بعداً
توسط همان گروه بهبود یافت.افزودن متانل و سولفات آمونیوم به محلولی از آبی کوماسی
G-۲۵۰ در اسید فسفریک رقیق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئیدی آن سوق میدهد.
در طی رنگ آمیزی، تعادلی بین اشکال کلوئیدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد.
فرم پراکنده رنگ وارد ماتریکس ژل می شود و پروتئین ها را رنگ می کند. حال آنکه فرم
کلوئیدی بیرون نگه داشته می شود و به این ترتیب از رنگ آمیزی زمینه پرهیز می شود.
پروتکل های متعددی برای رنگ آمیزی با کوماسی و نیز تعداد مختلفی رنگ کوماسی وجود
دارد. این روشها سریع و ارزان هستند هرچند که مرحله تهیه رنگ می تواند اندکی همراه
با آلودگی با رنگ باشد. بهتر است محلول رنگ را به فواصل زمانی مشخصی تجدید کرد
چون رنگ کهنه حساسیت خود را از دست می دهد. همچنین می توان محلولهای آماده
رنگ را البته با قیمت بیشتر خریداری کرد. اغلب شرکتهایی که این رنگها را تولید میکنند
ادعا می کنند که این رنگها از رنگهای کوماسی مرسوم حساستر هستند و رنگ زدایی
کمتر احتیاج دارند و بعلاوه، مواد غیر پروتئینی از جمله پلی ساکاریدها را هم رنگ میکند.
تمام مراحل کار روی یک شیکر چرخان با دور ملایم انجام می شوند. بدنبال الکتروفورز،
ژل را در محلول رنگ کوماسی کلوئیدی قرار می گیرد. محلول رنگ را پیش از استفاده
نباید صاف کرد. ژل حدود ۶ ساعت یا شب تا صبح درمحلول رنگ قرار داده می شود. در
انتها ژل چندین بار با آب مقطر شسته می شود تا زمینة ژل شفاف شود .
رنگ آمیزی نیترات نقره
رنگ آمیزی نقره ژلهای پلی آکریل آمید اولین بار در سال ۱۹۷۹ توسط Switzer و همکارانش،
معرفی شد، و به دلیل حساسیت بالای آن به سرعت عمومیت پیدا کرد. حساسیت این
روش حدودا” صد بار بیشتر از روش رنگ آمیزی با آبی کوماسی است.
با این وجود، دستورالعمل های اولیه رنگ آمیزی نقره خالی از اشکال نبودندو رنگهای پس
زمینه روی ژل و متعاقباً کاهش حساسیت و کاهش تکرارپذیری مکرراً تجربه می شد.این
موضوع منجر شد به اینکه بسیاری از نویسندگان پروتوکل های اصلاح شده ای را پیشنهاد
کنند بنحوی که امروزه بیش از یکصد پروتوکل مختلف برای رنگ آمیزی نقره در منابع علمی
یافت می شود. با این وجود ، تمام این روشها بر پایه اصول مشترکی قرار دارندمرحله اول
عبارتست از تثبیت یا fixation و هدف آن غیرمحلول نمودن پروتئین ها در درون ژل و نیز
شستن ترکیبات تداخل کننده ای است که در ژلهای ۲-D وجود دارند, از جمله گلایسین،
تریس ، SDS و کریرآمفولایت هایی که در ته ژلها وجود دارند.مرحله دوم حساس نمودن
است و هدف از این مرحله افزایش دادن امکان ظهور نقاط در مراحل بعدی است. ترکیبات
بی شماری برای این منظور پیشنهاد شده اند.
تمام این ترکیبات به پروتئین ها متصل می شوند و همچنین قادرند که به یون نقره متصل
شوند و یا اینکه یون نقره را به نقره فلزی یا سولفید نقره تبدیل کنند.
مرحله حساس نمودن گاهی با مرحله فیکس کردن همزمان انجام می شود.مرحله سوم
اضافه کردن نقره است که در این مرحله می توان از نیترات نقره ساده یا نقره آمونیاکی
استفاده کرد.مرحله چهارم و آخر عبارتست از ظهور ژلهایی که در نیترات نقره غوطه ور
بوده اند. محلول ظهور حاوی فرم آلدئید ، کربنات و تیوسولفات است. استفاده از ترکیب
اخیر که توسط Blum و همکاران معرفی شده است باعث کاهش قابل ملاحظه ای در
پس زمینه و نیز ظهور کامل تصویر می شود.
در ژلهایی که در محلول نقره آمونیاکی بوده اند محلول ظهور باید حاوی فرمالدئید و اسید
سیتریک باشد. برای کاهش رنگ زمینه همچنین می توان ژل را پیش از مرحله ظهور
مختصراً در تیوسولفات قرار داد یا اینکه آنرا درمحلول ظهور لحاظ کرد. زمانی که حدمطلوب
ظهور تصویر بدست آمد، با قراردادن ژن در محلول متوقف کننده از ادامه ظهور جلوگیری
می شود.
این محلول عموماً محتوی اسیداستیک و یک آمین است که pH آنرا به ۷ برساند. تثبیت
نهایی تصویر ژل با شستن کامل آن در آب بدست می آید.عموما” از ظروف شیشه ای
یا ظروف دردار پلی اتیلن برای رنگ آمیزی نقره استفاده می شود. ظروف پلاستیکی
هرچند ارزانتر هستند ولی تمیز کردن آنها سخت تر است. همچنین بسیار باید مراقب
بود که خراشیده نشوند چراکه این خراشها مخزن نقره خواهند شد و در رنگ آمیزی
اختلال ایجاد خواهند کرد. باقیمانده نقره را به سادگی می توان از این ظروف پلاستیکی
توسط یک پارچه نرم آغشته به اتانل پاک کرد. اگر این روش کافی نبود می توان با محلول
احیا کننده Farmer رنگ را به سادگی پاک نمود. ترکیبات این محلول عبارتند از : ۱/۰
درصد کربنات سدیم ، ۳/۰ درصد هگزاسیانوفرات[III] پتاسیم، و ۶/۰ درصد تیوسولفات
سدیم .
در انتها شستن جعبه با آب و اتانل این پروسه را کامل می کند.مواد مورد استفاده در این
روش بطور کلی باید دارای رتبه استاندارد pro-analysis باشند:آب باید بوسیله رزین های
تعویض یونی خالص شده باشد و با داشتن مقاومت بیشتر از پانزده مگااهم بر سانتیمتر
(>۱۵MΩ/cm) دارای کیفیت مناسب باشد. استفاده از آب مقطر می تواندهمراه با نتایج
غیرقابل پیش بینی باشد.از محلول ۴۰%-۳۷ فرمالدئید استفاده می شود. این محلول
در دمای اتاق تا ماه ها پایدار است. نگهداری این محلول در دمای ۴ درجه سانتیگراد
منجر به پلیمریزه شدن و رسوب آن می شود.تیوسولفات سدیم بصورت محلول ۱۰%
وزن به حجم (w/v) پنتاهیدراتِ تیوسولفات سدیم در آب مورد استفاده قرارمی گیرد.
مقادیر کمی از این محلول مثلاً ۱۰ میلی لیتر، بصورت هفتگی تهیه و در دمای اتاق
نگهداری می شود.گلوتارآلدئید : بصورت محلول ۵۰% خریداری میشود و در دمای ۴
درجه سانتیگراد تا ماه ها نگهداری می شود. گلوتارآلدئید مورد استفاده باید از کیفیت
خوبی برخوردار باشد اما درهرحال استفاده از نوع Microscopy-grade آن لزومی ندارد.
از محلول های زرد رنگ آن نباید استفاده کرد.اتانل ۹۵% را می توان بدون هیچ محاسبه
حجم بکار برد و نیز نیازی به اتانل خالص نیست.
استفاده از الکل های تقلیبی (denatured) توصیه نمی شود.محلول۲ مولار اسیدسیتریک
را می توان تهیه و تا ماه ها در دمای اتاق نگهداری کرد.محلول استات پتاسیم : غلظت ۵
مولار تا ماهها در دمای اتاق قابل نگهداری است.محلول یک نرمال نیترات نقره (Fluka) از
پودر آن ارزانتر است و تا ماهها در یک ظرف تیره در یخچال قابل نگهداری است.محلول یک
نرمال هیدروکسیدسدیم به کار می رود.محلول ۵ نرمال هیدروکسید آمونیوم را می توان
تهیه و در یخچال نگهداری کرد.برای رنگ آمیزی هر ژل ، حجم محلول مورد استفاده در هر
مرحله باید حداقل پنج برابر حجم ژل باشدبه طوریکه محلول کاملا” ژل را بپوشاند. تعدادی
از پروتکل هایی که می توانند مورد استفاده قرار بگیرند در ذیل ملاحظه می شوند.
رنگ آمیزی نقره آمونیاکی
محلول فیکساسیون که عبارتست از ۲۵% حجمی اتانل و ۴% حجمی فرمالدئید.محلول
حساس کننده حاوی ۰۵/۰ درصد (w/v) ۲-۷ نفتالن دی سولفات دی سدیم محلول نقره
آمونیاکی که به این صورت تهیه می شود:
۴۸۰ میلی لیتر آب درون یک فلاسک ریخته میشود و با همزن مغناطیسی شدیدا” مخلوط
می شود.. سپس به آن به ترتیب ۵/۷ میلی لیتر محلول یک نرمال هیدروکسید سدیم ،
۵/۷ میلی لیتر محلول ۵ نرمال هیدروکسید آمونیوم و ۱۲ میلی لیتر محلول یک نرمال نیترات
نقره افزوده می شود. درحین افزودن محلول نیترات نقره یک رسوب قهوه ای بطور گذرا پدیدار
می شود که باید ظرف چند ثانیه ناپدید شود. محلول مورد استفاده باید کاملاً شفاف باشد.
این محلول برای رنگ آمیزی ۴ ژل کوچک کافی است.
محلول ظهور حاوی یک میلی لیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و ۱۸۰ میکرولیتر اسید سیتریک۲
مولار در یک لیتر می باشد .محلول توقف حاوی بیست میلی لیتر اسیداستیک و ۵ میلی
لیتر اتانل آمین در لیتر است.این روش مبنی بر روش Eschenbruch و Bürk است که در
کلیات آن تغییراتی ایجاد شده است.
برای حصول نتایج مطلوب تغییراتی باید در سطح قالب ریزی ژل ایجاد شود. بدین ترتیب که
بجای استفاده از بیس اکریلامید از پیپرازین دی اکریلامید (PDA) استفاده می شود.
همچنین تیوسولفات نیز در مرحله پلیمریزاسیون به ژل افزوده می شود. درعمل ، سیستم
آغازگر متشکل از یک میکرولیتر TEMED، ۱۰میکرولیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم و
۱۰ میکرولیتر محلول ۱۰% پرسولفات آمونیوم به ازای هرمیلی لیتر از مخلوط ژل می باشد.
این مقادیر متضمن شکل گیری صحیح ژل و حداقل رنگ زمینه درطی رنگ آمیزی می باشد.
بعد از الکتروفورز ، روش رنگ آمیزی نقره به شرح زیر انجام می شود :
- قالب ژل را بازکنید و ژل را ۵ تا ۱۰ دقیقه در آب بشویید.
- ژل را یک ساعت درمحلول فیکس کننده قراردهید
- دو مرحله پانزده دقیقه ای ژل را درآب بشویید.
- ژل را در محلول حساس کننده از شب تا صبح قراردهید.
- شش مرحله بیست دقیقه درآب بشویید.
- درمحلول نقره آمونیاکی بمدت ۳۰ تا ۶۰ دقیقه قراردهید.
- شش تا بیست دقیقه در آب بشویید.
- ژل را درمحلول ظهور ظاهر کنید.
- ظهور را با محلول توقف خاتمه دهید. ژل را نیم تا یک ساعت در این محلول قرار دهید.
- پیش از خشک کردن یا دانستیومتری ، ژل را چندبار با آب بشویید.
محلول های مورد نیاز برای روش رنگ آمیزی نقره سریع :
محلول فیکس : ۵% اسیداستیک ، ۳۰% اتانلمحلول حساس کننده : ۲ میلی لیتر محلول
۱۰% تیوسولفات سدیم در لیتر.
محلول نقره : ۷/۰ میلی لیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و ۵/۱۲ میلی لیتر محلول یک نرمال
نیترات نقره در لیتر.
محلول ظهور : ۳۰گرم کربنات پتاسیم خشک ، ۲۵۰ میکرولیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و
۱۲۵ میکرولیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم در لیتر.
محلول توقف : ۴۰گرم تریس و ۲۰ میلی لیتر اسیداستیک در لیتر.این پروتکل براساس
روش Blum و همکاران که در آن تغییراتی داده شده است, انجام می شود.
- ژل را ۳ تا ۳۰ دقیقه درمحلول فیکس کننده قراردهید.
- ژل را با آب ۲ بار و هر مرتبه ۱۰ دقیقه بشویید.
- برای حساس کردن ژل آنرا یک دقیقه درمحلول حساس کننده قرار دهید.
- ۱ دقیقه در آب قرار دهید.
- حداقل ۳۰ دقیقه در محلول نقره قراردهید.
- ژل را ۵ الی ۱۵ ثانیه در آب بشویید.
- تصویر را درمحلول ظهور ظاهر کنید. این مرحله ۱۰ الی۲۰ دقیقه طول می کشد .
- ظهور را به مدت ۳۰ الی ۶۰ دقیقه با محلول توقف خاتمه دهید.
- ژل را پیش از خشک کردن یا دانسیتومتری چندبار با آب بشویید.
رنگ آمیزی نقره ژلهای دارای فیلم نگهدارنده:
محلول فیکس : ۵% اسیداستیک ، ۳۰% اتانلمحلول حساس کننده : ۵/۰ مولار استات
پتاسیم ، ۵/۰ درصد گلوتارالدئید ، ۲۵% اتانل و ۳ گرم در لیتر تتراتیونات پتاسیم.
محلول رنگ آمیزی نقره : ۵/۰ میلی لیتر فرمالدئید ۳۷% و ۵/۱۲ میلی لیتر محلول نقره
یک نرمال در یک لیتر محلول.
محلول ظهور : ۳۰گرم کربنات پتاسیم خشک ، ۲۵۰ میکرولیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و
۱۲۵ میکرولیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم در لیتر.
محلول توقف : ۴۰گرم تریس و ۲۰ میلی لیتر اسیداستیک در لیتر.در این روش تنها در هر
ظرف می توان یک ژل را رنگ آمیزی کرد.ژل را فیکس کنید (۳*۳۰ دقیقه).ژل را ۳۰ الی
۶۰ دقیقه درمحلول حساس کننده قراردهید .در آب بشویید (۱۵ * ۴ دقیقه ).بمدت ۵ الی
۱۰ ثانیه با آب بشویید ( نکته ۸ را ببینید).با استفاده از محلول توقف ظهور بمدت ۳۰ الی
۶۰ دقیقه ظهور را متوقف کنید.پیش از خشک کردن یا دانسیتومتری از ژل چندبار آنرا در
آب بشویید.
نکته ها :
تفاوت در پروتکل های مختلف رنگ آمیزی نقره یا مربوط به زمان هرمرحله و یا در ترکیب
محلولهای هرمرحله هستند. تغییرات عمده در ارتباط با غلظت معرف نقره، یا ماهیت و
غلظت محلول حساس کننده می باشند. تنها موارد معدودی از مقایسه پروتکل های
رنگ آمیزی نقره منتشر شده اند .
از میان این مقایسات ، پروتوکل های منتخب در بخشهای قبلی ارائه شدند. انتخاب
یک پروتوکل به امکانات آزمایشگاهی یک آزمایش و نیز به نیازهای آزمایشگر (سرعت ،
قابلیت تکرار و غیره ) بستگی دارد. رهنمود های زیر را می توان در این رابطه پیشنهاد
کرد :
- حداکثر حساسیت از یک روش به روش دیگر تفاوت گسترده ای ندارد. تفاوتها اصلی
در یکنواختی رنگ آمیزی از یک پروتئین به پروتئین دیگر ، قابلیت تکرار در رنگ آمیزی ،
سرعت روش، و انطباق آن بر پروتکل های مختلف ۲-D است.
- به طور کلی، روش هایی که در آنها از نقره آمونیاکی استفاده می شود نتایج بسیار
یکسانی بدست می دهند و آثار رنگی (Color Effects) آن حداقل هستند و بنابراین
برای ژلهای ۲-D که در آنها از محدوده وسیع pH استفاده میشود بسیار توصیه میشوند.
با این وجود ، این روشها دارای نقصهای کوچکی هستند که مانع استفاده عمومی
آنها می شود.
- معرف نقره نسبت به غلظت آمونیاک بسیار حساس است. از آنجا که آمونیاک بسیار
فرار است باعث مشکلاتی در تکرار پذیری این روش در طی زمان میشود. با استفاده
از محلولهای آمونیاک تیترشده تجارتی می توان تا حدود زیادی این مشکلات را برطرف
نمود.
- نقره آمونیاکی با تمام سیستم های ژلهای SDS سازگار نیست. سیستم هایی که در
آنها از Tricine یا Bicine بعنوان یون دنبال کننده استفاده می شود با رنگ آمیزی نقره
آمونیاکی سازگار نیستند.
- رنگ آمیزی نقره آمونیاکی برای ژلهایی که فیلم نگهدارنده دارند توصیه نمی شود. در
چنین مواردی آینه های نقره ای در ژل مکرراً مشاهده می شود.
- پروتکل های مناسب برای رنگ آمیزی نقره آمونیاکی عموماً زمانبر هستند. بعلاوه ، با
استفاده از ژلهای دست ساز ( غیرخریداری ) که در آنها از PDA بعنوان اتصال جانبی و
نیز از تیوسولفات در مرحله پلیمریزاسیون استفاده شده است نتایج مطلوبتری بدست
می آید.
این موضوع مانع استفاده از ژلهای تجارتی می شود. بعلاوه این پروتوکلها زمانی بهترین
نتایج را بدست می دهند که از آلدئیدها ( فرمالدئید یا گلوتارالدئید ) بعنوان فیکس کننده
و یا حساس کننده استفاده شود. ولی این مواد مانع از بازیافت پروتئین های رنگ آمیزی
شده با نقره برای استفاده های بعدی مثلاً در Mass Spectrometry می شود.
رنگ آمیزی با رنگهای فلئورسانت, نظیر SYPRO Ruby روشی بهینه شده برای آشکارسازی
پروتئین ها در الکتروفورز دو بعدی است. این رنگها با تجارب مربوط به پروتئومیکس بسیار
سازگار هستند. حساسیت رنگ SYPRO Ruby قابل مقایسه با رنگ امیزی نقره است و
بر خلاف نیترات نقره دارای محدوده ی دینامیکی گسترده ای است. به همین دلیل امکان
تعیین کمیت و اندازه گیری دقیق را می دهد.
رنگ آمیزی با SYPRO Ruby با روشهای طیف سنجی جرمی نیز سازگار است.تغییری
هوشمندانه در الکتروفورز دوبعدی با استفاده از رنگ های فلئورسانس موجب ابداع روشی
جدید به نام الکتروفورز ژل افتراقییا DIGE شده است. در این روش پروتئین ها در هر یک از
دو نمونه مورد مقایسه با رنگ فلئورسانس متفاوتی برچسب گذاری می شوند. سپُ آنها
بر روی یک ژل تفکیک می شوندو با آشکارسازی تفاوت بین دو نمونه مورد مقایسه قرار
می گیرد. از این طریق اختلاف ناشی از استفاده از ژل های متعدد از بین می رود.
کیفیت ژلهای ۲DE
ظرفیت تفکیک کنندگی ژلهای الکتروفورز دوبعدی بستگی به طول جداسازی در هر
دو بعد دارد و معمولاً متناسب با کل مساحت ژل که درحین جداسازی در دسترس
است درنظرگرفته می شود .
با استفاده کردن از ژلهای IPG ۱۷ سانتی متری استاندارد و ژلهای SDS-PAGE ۲۰
سانتیمتری میتوان حدود ۲۰۰۰ پروتئین را در یک مخلوط پروتئین پیچیده مثل مخلوط
های لیزشدة بافتی یا لیز کامل سلولی, به سهولت از همدیگر تفکیک کرد.
با استفاده از قالبهای ژلهای کوچک (مینی ژل)فقط چندصد پروتئین میتوانند از هم
دیگر جدا شوند. اما کارکردن با این فرمتها بسیار راحت تر انجام می شود و برای
غربالگری سریع بسیار مناسب است. برای بدست آوردن بالاترین و حداکثر قدرت
تفکیک مورد نیاز برای مخلوطهای پروتئینی بسیار پیچیده, ژلهایی با فرمتهای بسیار
بزرگ میتوانند مورد استفاده قرارگیرند که در این صورت میتوانند بین ۰۰۰/۱۰-۰۰۰/۵
پروتئین را از محلولهای لیز سلولی از همدیگر جداکنند. به هرحال مزایای خاصی
در استفاده کردن از ژلهای IPG که چندین محدوده pH را با همدیگر می پوشانند
برای استفاده از یک نقشة پروتئینی ترکیبی از نمونه های پیچیده وجود دارد.
تکرارپذیری الکتروفورز دوبعدی
تا گذشتة نه چندان دور تکرارپذیری مشکل اصلی محدودیت استفاده گسترده از
الکتروفورز دوبعدی بود . استفاده از ژلهای لوله ای کلاسیک که در روش اوفارل
(O’ffarel) معرفی شده بود معمولاً جداسازیهای تکرارپذیر را بسیار مشکل میکرد
که حتی این کار در مورد یک نمونة مخصوص در داخل یک آزمایشگاه بسیار مشکل
بود ، درحالی که مقایسة جداسازی الکتروفورز دوبعدی در آزمایشگاه های مختلف
بسیار پراهمیت تلقی می گردد. استفاده کردن از ابزار ۲DE مشخص کمک شایان
توجهی به حل این مشکل نموده است. در این وضعیت می توان تعداد بسیار زیادی
از ژلهای ۲DE را بطور همزمان انجام داد و در این حال شرایط تکرارپذیری را قابل
کنترل کرد.مهمتر از آن مطالعات بین آزمایشگاهی نمونه های مختلف نشان داده
است که الکتروفورزدوبعدی با استفاده از IPG تکرارپذیری بسیاربالایی را نشان
می دهد.
جلوگیری از ایجاد رگه های افقی و عمودی در ژلهای الکتروفورز دوبعدی
به عنوان اصلی کلی و فراگیر می توان اظهار داشت که بروز رگه های افقی بعلت
عدم فوکوسینگ کامل و بهینه پروتئینها در بعد اول الکتروفورز و پدیداری رگه های
عمودی ناشی از جداسازی ناقص پروتئینها در بعد دوم الکتروفورز است.
دلایل بروز رگه های افقی و روش های جلوگیری از آن
استفاده از ولت ـ ساعت اضافی در بعد اول- همیشه برای رسیدن به تفکیک بهتر
نیاز به استفاده از دورة فوکوسینگ طولانی تر نیست. چون همین وضع می تواند
منجر به بروز رگه های افقی شود. بعضی از نمونه های پروتئینی نسبت به سایر
پروتئینها فوکوسینگ آسان تری دارند.
بنابر این برای هر نمونه ولت ـ ساعت مناسب به صورت تجربی تعیین می شود.
فوکوسینگ ناکافی در بعد اول الکتروفورز – فوکوسینگ ناکافی نیز رگه های افقی
ایجاد می کند. بنابراین باید از مناسب بودن کل ولت – ساعت که برای طول و
محدودة pH در هر نوار IPG استفاده می شود, اطمینان حاصل کرد. فوکوسینگ
بیش از اندازه برای یک نمونه، یا انجام IEF همزمان برای نوارهای IPG با محدودة
pH متفاوت در در یک سینی فوکوسینگ خود عاملی برای فوکوسینگ ناکامل
پروتئینها است.استفاده از پروتئین زیادی – مقدار کل پروتئینی که به IPG منتقل
می شود به طول IPG و روش رنگ آمیزی برای دیدن نتایج بستگی دارد. البته نکات
جانبی مهمی را باید درنظر داشت. به عنوان مثال، وقتی از نمونة پروتئینی خاصی
استفاده می شود که دارای یک نوع پروتئین بافراوانی زیاد است، مانند آلبومین
سرم که ۹۰%-۷۰ کل پروتئین سرم را تشکیل میدهد, در صورت بارگیری به اندازه
معمول, حضور انواع دیگر پروتئینها تحت الشعاع آلبومین قرار می گیرد. برای مقابله
با این وضعیت باید از بارگیری بیشتر نمونه اجتناب نمود و در عوض با روشی مناسب
آلبومین را حذف کرد.
بکاربردن پروتئین اضافی در بارگیری رگه های افقی را بدتر میکند. بارگیری زیاد
پروتئین در پیاله بارگیری – درحین بارگیری با پیاله یا مقدار زیاد نمونه باعث تجمع
پروتئینها می شود و این مسأله منجر به رسوب پروتئین در نقطة ایزوالکتریک می
شود که خود عاملی برای ایجاد رگه های افقی است.در این حال افزایش جزئی
در حجم دهیدراتاسیون (تا ۱۰%) فوکوسینگ را بهتر می کند.
مشکلات آماده سازی نمونه – هر ماده ای که دارای بار الکتریکی باشد می تواند
IEF را تحت تأثیر قرار می دهد و به بروز رگه های افقی منجر شود. آلودگی های
شایع ، نمک، دترژنت، اسیدنوکلئیک، لیپید و یا ترکیبات فسفوریک هستند.
رسیدن سریع شدت جریان به جریانی که از قبل تعیین شده است (معمولا” ۵۰
میکروآمپر به ازای هر نوار) در اوایل و در ولتاژ ی پایین, نمایانگر وجود آلودگی های
یونی در نمونه است. در صورتی که میزان ولت ـ ساعت برای حذف آلودگی یونی
و در عین حال فوکوس شدن پروتئینها کافی نباشد, ولتاژ های پایین تر منجر به
IEF طولانی و ظهور رگه های افقی می شوند. به هر فوکوسینگ طولانی نیز
می تواند به داغ شدن بیش از حد نوار IPG و سوختن آن منجر می شود.
آسانترین راه برای حل این مشکل ، کاهش قدرت یونی نمونة پروتئینی است.
اگر مشکل نمک موجود در نمونه باشد، نمونه باید نمک زدایی شود. دترژنتهایی
با شارژ مشخص مانند SDS می توانند پروتئینها را بپوشانند و به شدت شارژ
پروتئینها را تغییر دهند و در نتیجه نقطة ایزوالکتریک آنها را تحت تأثیر قرار داده
و رگه های افقی ایجاد کنند.
آلودگی نمونه با اسید نوکلئیک نیز رگه های افقی ایجاد می کند. تعداد زیادی از
پروتئینها با اسیدنوکلئیک باند می شوند و مجموعه هایی از پروتئین اسیدنوکلئیک
ایجاد می کنند که به شدت نقطة ایزوالکتریک را تغییر می دهند.
اسیدهای نوکلئیک را می توان با مجاور کردن نمونه با نوکلئاز قبل از IEF حذف کرد.
با روش دیگری، اسیدهای نوکلئیک را با استفاده از اولتراسانتریفوژ درحضور اسپرامین
می توان خارج کرد.
پلی ساکاریدهایی که حاوی اسید سیالیک هستند شارژ منفی داشته و میتوانند
رگه های افقی شبیه اسیدهای نوکلئیک ایجاد کنند.
پلی ساکاریدهای بدون شارژ نیز می توانند از طریق بستن سوراخهای ژل, از وارد
شدن نمونه به درون IPG, رگه های افقی ایجاد کنند و فوکوسینگ را مختل میکند.
گاهی اولتراسانتریفوژ برای حذف کربوهیدراتها کافی است.
به علاوه کاربامیلاسیون پلی پپتیدها در بعضی پروتئینها ایجاد شارژ ناهمگون میکند
و نقاط مجزایی ایجاد می کند، تحت شرایط خاص مانند زمانی که از محدوده pH
وسیع استفاده می شود به دنباله دار شدن نقاط منجر میشود. نمونه های پروتئینی
باید با استفاده از اورة کاملاً خالص تهیه شوند و بیش از ۳۰ درجه سانتیگراد حرارت
نگیرند.
آخرین علت بروز رگه های افقی مربوط به تهیه نمونه، وجود باندهای دی سولفید
است. زمانی که پیوندهای دی سولفید قبل ازالکتروفورز دو بعدی و به اشکال بین
مولکولی و داخل مولکولی در پروتئین های محلول ایجاد می شوند ، اشکال متفاوت
پروتئینی ایجاد می شوند که اختلاف اندکی در pI پروتئینها ایجاد می کند. در ژل
۲D به شکل پهن شدن یک نقطه تنها دیده می شوند. مولتی مرها یی از پروتئینهای
مشابه ، به شکل نقاط دنباله دار، نقاط فانتوم ، نقاط از تخریب شده ظاهر می شوند.
حلالیت کم پروتئین – اشکال در حل شدن کامل همة پروتئینها در یک نمونه، باعث
بروز رگه های افقی می شود. علاوه بر استفاده از ترکیبات کائوتروپ و دترژنت ها
برای افزایش حلال یت, سانتریفوژ کردن قبل از IEF و حذف کمپلکسهای پروتئینی
حل نشده راهی مناسب برای حل این مشکل است.جریان الکترو اندواسمیک –
یکی از مشکلات در IEF پروتئینهای بازی جریان الکترواندواستمیک است که به
علت حرکت آب از کاتد به آند، رگه های افقی ایجاد می کند. جریان آب می تواند
باعث کند شدن حرکت پروتئینها در مسیر مخالف شود و در نتیجه فوکوسینگ
کامل انجام نشود. بعلاوه خشک شدن IPG در کاتد ، قطر سوراخهای ژل را در آن
ناحیه کاهش می دهد در نتیجه حرکت پروتئین کندتر شده و فوکوسینگ کامل
نمی شود. همچنین خشک بودن IPG باعث تجمع پروتئین می شود و رگه های
افقی را بوجود می آورد.
با استفاده از جاگذاری Paper wick در انتهای کاتد و آغشته به آب و استفاده از
گلیسرول, ایزوپروپیل الکل یا متیل سلولز به محلول نمونه وبافر خیساندن این
مشکل مرتفع گردیده است.
۷-۲-۲- دلایل بروز رگه های عمودی و روش های جلوگیری ازآن
حلال یت کم پروتئین – درطی جداسازی بعد اول، تمام پروتئینها به طرف نقطة ایزو
الکتریک خود حرکت می کنند و هیچ شارژ مشخصی ندارند. قدرت یونی شبکه ژلی،
خیلی کم استبه همین دلیل یونهای کوچک همگی از ژل IEF خارج می شوند.
پروتئینها تحت این شرایط حلال یت کمی دارند و همه در ژل ماتریکس علیرغم حضور
دترژنتها، عوامل کائوتروپ و دیگر افزودنیهای حلال رسوب می کنند. هدف اصلی از
مرحلة متعادل سازی بعد از IEF پوشاندن این پروتئینها با SDS بوده که با دادن شارژ
منفی به آنها مجدداً این پروتئینها حل شده و آنجا وارد ژل بعد دوم شوند.بارگیری
زیاد پروتئین – وقتی که مقدار زیادی پروتئین بارگیری می شود و یا زمانی که محتوی
پروتئینی نمونه فراوانی زیادی دارد, ممکن است حل کردن مجدد پروتئینها در مرحلة
متعادل سازی کامل انجام نشود.
در نتیجه رگه های عمودی ایجاد می شود و بیشتر نقاط پروتئین دنباله دار خواهند
بود. این مشکل را می توان با بارگیری کمتر پروتئین در ژل بعد اول مرتفع ساخت.
فوکوسینگ بیش از اندازه – با افزایش زمان فوکوسینگ رسوب ایزوالکتریک اتفاق
می افتد که منجر به رگه های عمودی میشود بنابراین با جلوگیری از فوکوسینگ
بیش از حد می توان از رگه های را کاهش داد.
متعادل سازی غیرمؤثر – متعادل سازی باید به گونه ای انجام شود که اطمینان کامل
از نفوذ SDS و حلال یت پروتئنها حاصل گردد. سینی متعادل سازی باید حرکت کند
تا از حرکت محلول روی ژل مطمئن باشیم.
اگر نیاز باشد می توان زمان متعادل سازی را تا ۴۵ دقیقه افزایش داد. البته احتمال
دارد از این طریق بعضی پلی پپتیدهای کوچک ( کمتر از KD۱۵ ) از دست برود اما
حذف پروتئینهای بزرگتر حتی با متعادل سازی طولانی ناچیز است.
غلظت SDS باید حداقل ۲% باشد, بویژه اگر غلظت دترژنت استفاده شده در بعد
اول بیش از ۲% بوده است.
دیگر ترکیبات محلول متعادل سازی نیز حائز اهمیت هستند. محلول استفاده شده
باید بافر شود بویژه اگر یک مرحلة قلیایی بکار گرفته می شود زیرا استفاده از آیود و
استامید تولید اسید می کند. بهترین تامین کننده ی pH مطلوب برای متعادل سازی,
گلیسرول است که باید با غلظت حداقل ۲۰% در محلول موجود باشد گلیسرول یکی
از ترکیبات مهم محلول متعادل سازی است و کمبود آن ایجاد رگه های عمودی میکند.
اکسیداسیون پروتئینها – باید در تمام مراحل الکتروفورز دوبعدی از اتصال متقاطع
اکسیداتیو (اکسیداسطون گروهای نیول آزاد) و تاخوردگی مجدد پروتئینها ممانعت به
عمل آورد. اکسیداسیون پروتئین درطول جداسازی بعد دوم می توان رگه های عمودی
را ایجاد کند.
برای جلوگیری از اکسیداسیون مجدد گروههای سولفیدریل آزاد سیستئین باید آنها را
آلکیله کرد. الکیلاسیون می تواند قبل از IEF صورت گیرد.
اگر نمونه الکلیله نباشد الکلیلاسیون باید در مرحلة دوم متعادل سازی با یدواستامید
۵/۲% انجام شود.کیفیت ضعیف مواد یا اشتباه در تهیه محلول ها – رگه های عمودی
و دیگر مشکلات دربعد دوم از کیفیت ضعیف مواد و اشتباه در ساخت محلولها نیز بوجود
می آید. باید در استفاده از مواد با کیفیت خوب دقت شود و از درست بودن pH تمام
بافرها اطمینان وجود داشته باشد. ژلهای بعد دوم از قبل آماده شده باید قبل از تاریخ
انقضاء استفاده شود. اکریلامید با کیفیت پائین و محلول ذخیرة آکریلامید قدیمی به
علت پلیمریزاسیون ناکامل در بعد دوم رگه های عمودی ایجاد می کند. اگر از بافر
مصرف شده ی تانک الکتروفورز در SDS-PAGE مجدداً استفاده شود، جداسازی ضعیف
بوده و رگه های عمودی به علت کاهش یونها و SDS ایجاد می شود.
جای گذاری نادرست نوار IPG روی ژل بعد دوم – رگه های عمودی در اثر ایجاد فاصله
بین نوار IPG و ژل بعد دوم نیز می توانند ایجاد شوند.سطح رویی ژل بعد دوم باید کاملاً
صاف باشد. سطح بالای ژل تراز بوده و باید نوار IPG در تمام طول در تماس مستقیم با
ژل بعد دوم باشد. نوار IPG در هنگام جاگذاری نباید خم شود و از این مسأله با اطمینان
از چسبیدن لبة پلاستیکی آن به لبة فوقانی ژل بعد دوم می توان جلوگیری کرد. اضافه
کردن آگارز از شل شدن نوار IPG و حرکت آن جلوگیری می کند. حبابهای هوا در آگارز
ریخته شده باید حذف شوند.
ظهور منافذ با اندازه های مختلف در نوار IPG به دنبال IEF – بعد از جداسازی در بعد
اول ممکن است ضخامت نوار IPG متفاوت می شود.
تورم یا نازک شدن بعضی از قسمتها در ژل به علت حرکت آب در ژل است. در نواحی
نازک تر اندازه ی سوراخ های ژل کوچکتر و حرکت پروتئین خارج ژل به داخل و رسیدن
به نقطة ایزوالکتریک را کاهش می دهد و یا حتی جلوگیری می کند و این مسأله رگه
های عمودی ایجاد می کند.
در موارد شدیدتر ، پروتئینها به علت گیرکردن در IpG کاملاً از بین می روند. حرکت آب
در طی بعد اول جداسازی را می توان از طریق حذف کامل نمک از نمونه و جلوگیری
از فوکوسینگ بیش از اندازه کاهش داد.
آنالیز تصویری
روشهای متفاوت در آشکارسازی ژل های الکتروفورز دو بعدی به فنون تصویربرداری
خاص خود نیاز دارند.
این فنون باید قادر به تشخیص علائم کروموژنیک مختلف و علائم فلورسانت باشند
برای این منظور از دستگاه های مختلفی چون اسکنر اسناد Document scanner,
دوربین CCD Charged -coupled device camera, و دانسیتومترهای لیزری استفاده
می شود.
با توجه به تعداد نقاط بسیار زیاد ةاهر شده بر روی ژل الکتروفورز دو بعدی, بهترین
روش آنالیز با استفاده از کامپیوتر صورت می پذیرد. با استفاده از ابزار کامپیوتری
میتوان حتی نقاط کمرنگ را تشخیص داد و تعیین اندازه کرد, تصاویر ژل های متفاوت
را با یکدیگر مقایسه نمود و تغییرات کمی بیان پروتئین ها را در ژل های تهیه شده
از یک نمونه در شراطی متفوت را مشخص نمود. چندین نرم افزار مطرح برای چنین
کاربردی در بازار موجود است:
Z۳ ساخت Compugen, Melanie V از Genbio و Amersham و PD Quest از BioRad.
تمامی این نرم افزارها ابتدا تصویر ژل را در برنامه نشان می دهندو قادر به ویراستن
تصاویر در قالب TIFF هستند. سپس این نرم افزارها به تشخیص نقاط می پردازند,
این کار به صورت خودکار صورت گرفته و قابلیت ویراستاری دستی را دارند. با تنظیم
نحوه ی تشخیص نقاط می توان این نحوه را برای یک سری از ژلها اعمال کرد. بعد از
این مرحله نرم افزارها شروع به تطابق نقاط یکسان بر روی یک سری از ژل های مورد
نظر و انتخاب شده می نمایند. اولین مرحله در این کار تعیین یکی از ژل ها به عنوان
ژل مرجع است. در ژل مرجع چندین نقطه ی پروتئینی به عنوان نقاط اصلی به منظور
پیدا کردن جفت های یکسان آنها بر روی ژل های دیگر تعیین می شوند. سپس تطابق
نقاط جفت شروع می شود. با انجام این مرحله نطابق کل نقاط ژل ها شروع خواهد
شد.
بعد از این مرحله ویراستاری و تصحیح دقیق تطابق های انجام شده صورت می گیرد.
این مرحله برای افزایش دقت در مقایسه بین ژل ها ضروری است. یکی از تواناییهای
این نرم افزارها امکان ایجاد ژلهای مصنوعی یا ژلهای میانگین Average gels با استفاده
از ژلهای تطابق یافته حاصل از یک نمونه در یک وضعیت مشخص است. این ژلهای
میانگین برای بررسی تغییرات در بیان پروتئین در بین دسته های مختلف ژلها بسیار
کار آمد هستند.
برخی مواقع در تصاویر ژلهای الکتروفورز دو بعدی اختلاف در شدت نقاط ناشی از اختلاف
در بیان پروتئین ها نیست, بلکه اختلاف در آماده سازی نمونه, میزان بارگیری, نحوه ی
رنگ آمیزی و حتی تصویر برداری موجد این اختلاف است. درچنین مواردی نرم افزار ها
قادر به نرمالیزه کردن تصاویز برای جبران این اختلاف در شدت نقای هستند.
اینکار توسط رجوع به نقاطی می شود که از عدم تغییر در میزان آنها در طی آزمایشهای
مختلف اطمینان وجود دارد.
در نهایت آنالیز اطلاعات شروع خواهد شد. در ابتدا نقاطی نشان داده می شوند که برای
آنها ویژگی خاصی تعریف شده باشد, مثلا” نقای تطابق یافته ای که بیش از دو برابر
اختلاف در ژلهاژ مقایسه شده دارند. وقتی که گروه خاصی از نقاط انتخاب شدندتغییرات
در شاخص های نقاط, مثلا” دانسیته نوری یا حجم نقای, به صورت هیستوگرامهایی
نشان داده خواهند شد. گزارش های آماری حاوی پارامترهای آماری نظیر میانگین ها,
انحراف معیار و واریاسیون ایجاد می شود. و آمارهای ساده ای چون آزمونStudent’s t-test
نیز در این نرم افزار ها اجرا می شوند.
جداسازی مخلوط های پروتئینی پیچیده با قدرت تفکیکی و قابلیت تکرارپذیر بالا, برای انجام
موفقیت آمیز پروتئومیکس بسیار پراهمیت است.
در سالیان اخیر ترکیب الکتروفورز دو بعدی,طیف سنجی جرمی, و ابزار بیوانفورماتیک در
مقیاس بسیار وسیعی برای تحقیقات پروتئومیکس به کار گرفته شده است. با استفاده
گسترده از الکتروفورز دو بعدی, محدودیت های این روش به تدریج مشخص شده اند. این
محدودیت ها عبارتند از:
با این روش نمی توان پروتئوم را به طور کامل آنالیز کرد. پروتئین های ظاهر شده بر روی
یک ژل فقط نماینده قسمتی از تمام پروتئین های موجود در نمونه هستند. به طور کلی
آن پروتئین هایی که در ژل ظاهر می شوند پروتئین هایی با فراوانی بالا در نمونه هستند.
پروتئین هایی که در تعداد نسخه های کم حضور دارند با روشهای رنگ آمیزی موجود نمایان
نمی شوند.
علاوه بر این پروتئین های بسیار بزرگ, بسیار کوچک, بازی و پروتئین های هیدروفوبیک نیز
در شرایط معمول آشکار نمی شوند. یکی از مشکلات اصلی در الکتروفورز دو بعدی پروتئین
های غشایی با هیدروفوبیسیته بسیار زیاد هستند که در روشهای محلول سازی رایج به
صورت محلول در نمی آیند.
دقت تعیین مقدار کمی نقاط به خصوص در رنگ آمیزی نقره زیاد نیست, چرا که محدوده ی
دینامیک این رنگ آمیزی وسیع نبوده و همینطور خصوصیت رنگ پذیری پروتئین ها با یکدیگر
متفاوت است.
کوماسی آبی برای اندازه گیری مقدار پروتئین ها مناسب تر است اما حساسیت آن کم
است.
اتوماتیک کردن آین روش بسیار سخت است و به همین دلیل روشی با ظرفیت آنالیز زیاد
نیست.
برای رفع این محدودیت ها, روشهای ابداعی زیادی برای الکتروفورز دو بعدی ایجاد شده
است. برای مثال استفاده از دترجنتهای قوی تر, جزء به جزء کردن نمونه, استفاده از IPG
با محدوده ی pH باریک, رنگ های فلورسانت و حتی روباتها برای بریدن و هضم آنزیمی
ژل ها. به علاوه پیشرفتهای زیادی نیز در ابداع و توسعة روشهایی جایگزین برای جداسازی
پروتئینها در پروتئومیکس بدست آمده است, اما هنوز هیچکدام نتوانسته اند جایگزین قابل
رقابتی برای الکتروفورز دوبعدی باشند. دلیل این امر خصوصیات ویژه ی این روش است
که عبارتند از:
غنای اطلاعات نهفته در داده های بدست آمده از الکتروفورز دو بعدی – اطلاعات مختلفی
از نقاط ظاهر شده بر روی ژل الکتروفورزبدست می آید. از جمله نقطه ی ایزوالکتریک, وزن
مولکولی و کمیت نسبی آن. در ترکیب با طیف سنجی جرمی هر نقطه را می توان تعیین
هویت و ویژگی نمود. با توجه به ظهور چندین صد نقطه بر روی یک ژل به حجم زیاد این
اطلاعات می توان پی برد.
امکان جداسازی و تعیین پروتئین هایی با تغییر بعد از ترجمه – در اغلب مواقع, پروتئینهایی
که بعد از ترجمه تغییر یافته اند به صورت دسته نقاطی که به صورت یک توده عمودی یا افقی
هستند در ژل الکتروفورز دو بعدی ظاهر می شوند. این پروتئین های تغییر یافته به سهولت
با طیف سنجی جرمی قابل تشخیص هستند.
قابلیت تفکیک زمانی و مکانی مراحل آنالیز پروتئوم – می توان الکتروفورز دو بعدی را در یک
آزمایشگاه تحقیقاتی انجام داد و بعد از انتخاب نقاط پروتئینی مورد علاقه, آنها را در زمانی
دیگر در مرکزی خدماتی, تعیین هویت کرد. به علاوه ژلهای خشک شده ی الکتروفورز دو
بعدی را می توان سالها نگاهداری کرد و سپس با طیف سنجی جرمی آنالیز نمود. بدین
ترتیب می توان بایگانی کم حجم و پر ارزشی را در اختیار داشت.
سهولت و ارزانی نسبی – انجام آن در مقایسه با دیگر روشها از سهولت بسیار بیشتری بر
خوردار است و اغلب آزمایشگاه ها با تکنیک های رایج الکتروفورز یک بعدی آشنایی دارند.
همچنین قیمت تجهیزات و مواد در مقایسه با دیگر روشها بسیار ارزانتر است.
به هر حال پیشرفت های اخیر به شدت توانایی های الکتروفورز دو بعدی را برای آنالیزر پروتئوم
افزایش داده است و به نظر می آید فعلا”, و البته تا آینده ای نه چندان دور, الکتروفورز دو بعدی
تکنیک اصلی در جداسازی پروتئین ها در پروتئومیکس باقی بماند.