وکتورهای کلونینگ
وکتور عاملی است که می‌تواند یک قطعه DNA را به سلول میزبان انتقال دهد. اگر برای تولید و تکثیر DNA به کار رود، کلونینگ وکتور نامیده می‌شود. در واقع یک وکتور کلونینگ، یک ناقل کوچک DNA است که در داخل خود یک قطعه DNA خارجی را می‌تواند حمل کند. قراردادن یک قطعه از DNA در یک وکتور کلونینگ به وسیله تیمار وکتور و DNA خارجی با آنزیم‌های محدودکننده یکسان امکانپذیر می‌باشد. بدین ترتیب می توان قطعات ایجاد شده را به یکدیگر متصل نمود.
وکتورهای کلونینگ ۳ جز مهم را دارا می‌باشند:
1) یک مبداء همانند سازی
2) ژن مارکر انتخابی (برای مثال ژن مقاومت به Amp)
3) چندین سایت کلونینگ که محل برش به وسیله آنزیم‌های محدودالاثر هستند.
یک مولکول DNA برای آن که بتواند به عنوان یک وکتور کلونینگ عمل کند باید چند ویژگی داشته باشد: اولین و مهم‌ترین ویژگی آن است که بتواند در سلول میزبان همانند سازی کند. بنابراین توسط آن کپی‌های متعددی از مولکولDNA نوترکیب ایجاد می‌شود و به سلولهای دختری منتقل می‌گردد. یک وکتور کلونینگ باید نسبتا کوچک باشد و اندازه آن کمتر از kb10باشد زیرا مولکول‌های بزرگ در حین تخلیص شکسته می‌شوند و همچنین دستکاری و تغییر دادن آنها مشکل تر است. دو نوع مولکول DNA که این ویژگی‌ها را دارد در سلولهای باکتریایی یافت می‌شود: کروموزوم‌های باکتریوفاژی و پلاسمیدی.
اگر چه پلاسمیدها غالبا به عنوان وکتورهای کلونینگ استفاده می‌شوند، دو نوع از تیپ‌های مهم وکتوری که امروزه کاربرد دارند از باکتریوفاژها مشتق شده‌اند.
معیارهای انتخاب یک وکتور کلونینگ
1. اندازه DNA قرار گرفته در وکتور: برای پروژه‌هایی که در آنها هدف کلون کردن قطعه ویژه‌ای از DNA است باید سایز DNA قرار گرفته در وکتور مناسب باشد. بیشتر پلاسمیدها می‌توانند DNA ای تا حد kb 15 را با خود حمل کنند. قرار دادنDNA بزرگتر در وکتور، مانع همانند سازی مناسب پلاسمیدها می‌شود (مخصوصا برای وکتورهای با رونوشت بالا). همچنین مشکلاتی برای پایداری DNA درج شده در پلاسمید ایجاد می‌گردد. برای کلون کردن قطعات بزرگ DNA انواع دیگری از وکتورها موجود هستند. این وکتورها برای ایجاد خزانه‌های DNA استفاده می‌شوند. این وکتورها از مجموعه‌ای از وکتورهای نوترکیب تشکیل شده‌است که طبق اصول کلون کردن بدست آمده‌اند. یک خزانه DNA از قطعات حاصل از برش ژنوم کامل یک موجود به وسیله آنزیم‌های اندونوکلئاز تشکیل شده‌است. کلنی‌های حاوی قطعات ژنتیکی جدا می‌شوند و از نظر وجود ژن‌های مورد نظر بررسی شده و کلنی حاوی ژن مورد نظر انتخاب می‌گردد.
2. تعداد رونوشت: وکتورهای کلونینگ مختلف بسته به واحد همانند سازی (رپلیکون) پلاسمید، تعداد کپی‌های متفاوتی دارند. پلاسمیدهای با منشاء Col E1، 15-20 کپی دارند. اما یک رپلیکون Col E1 جهش یافته همانند پلاسمیدهای سری pUC 700 ، 500 کپی دارد. این کپی‌ها در نتیجه یک جهش نقطه‌ای در مولکول تنظیمی RNA ІІایجاد می‌شوند که آن را نسبت به مهار یا RNAІ مقاوم تر می‌کند. هم چنین این جهش باعث حساسیت به دما می‌شود، به طوری که RNA ІІ جهش یافته نسبت به مهار باRNA І در دمای ˚۳۷ و ˚۴۲ مقاوم است اما در˚۳۰ مقاوم نیست. در این دما کپی پلاسمیدهای Col E1 غیرجهش یافته باز می‌گردد. در بعضی موارد یک کپی بالا ممکن است برای کلونینگ DNA مشکل ایجاد کند. برای مثال، DNA کلون شده ممکن است پروتئین‌هایی را کد کند که در مقادیر بالا برای سلول توکسیک باشند. حتی اگر پروتئینی از DNA کلون شده در سطح پائینی بیان شود، وجود کپی‌های زیاد از ژن داخل پلاسمید ممکن است سطح پروتئین را تا حد سمیت بالا ببرد. در این موارد استفاده از پلاسمیدهایی با تعداد کپی پایین تر می‌تواند سطح پروتئین را تا زیر حد سمیت کاهش دهد. برای مثال pBR322 دارای رپلیکون Col E1 هستند و بنابراین 15-20 رونوشت دارند. پلاسمیدهای سری PACY دارای رپلیکون P15A هستند که 18-22 رونوشت دارد. پلاسمیدهای با رونوشت پایین شامل pSC101 و BACS به ترتیب ۵ و ۱رونوشت دارند.
3. ناسازگاری: اگر ۲ یا چند نوع از پلاسمیدها نتوانند با هم در یک سلول میزبان وجود داشته باشند، گفته می‌شود که آنها به یک گروه ناسازگاری تعلق دارند.اما پلاسمیدهایی از گروه‌های ناسازگاری متفاوت می‌توانند با هم در یک سلول حفظ شوند. این اتفاق زمانی رخ می‌دهد که ۲ پلاسمید مختلف، حداقل از یک جز عملکردی مشترک برای همانند سازی و پارتیشن بندی جهت تقسیم سلولی استفاده نمایند. بنابراین رقابت برای استفاده ار اجزا عملکردی مشترک در سلول بوجود می‌آید و طبق مکانیسم انتخاب طبیعی پلاسمید غالب در سلول باقی مانده و پلاسمید دیگر حذف می‌گردد. سایز پلاسمید نیز در حفظ آن در روند کشت اثر می‌گذارد. به طوری که پلاسمیدهای بزرگ تر زمان طولانی تری برای همانندسازی نیاز دارند و توسط پلاسمیدهای کوچکتر که سریع تر همانندسازی می‌کنند از سلول حذف می‌شوند.
4. مارکر انتخابی: وارد کردن پلاسمیدها به سلولهای E.coli فرایند کارآمدی نیست. زیرا بسیاری از کلنی‌های حاصل فاقد مولکول پلاسمید بوده و تمیز دادن آنها از کلنی‌های دارای پلاسمید کاری بس دشوار می‌باشد. به علاوه سلولهای فاقد پلاسمید نسبت به سلولهای دارای پلاسمید رشد بهتری دارند. بعلت همانندسازی همزمان DNAکروموزومی و پلاسمید وارد شده در سلولهای دارای پلاسمید، این سلولها انرژی بیشتری را صرف تکثیر نموده و مسلما رشد کمتری خواهند داشت. بخصوص زمانی که پلاسمیدهای بزرگ و یا پلاسمیدهایی با تعداد رونوشت بالا در سلول وارد شده باشد. بنابراین روشی برای انتخاب کلنی‌های دارای پلاسمید مورد نیاز است. این امکان همیشه با حضور یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پلاسمید، فراهم می‌شود. اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت موجب می‌شود تنها سلول‌هایی که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک مربوطه را به دلیل حضور یک پلاسمید نوترکیب بیان می‌کنند، زنده بمانند و رشد کنند و سلولهای فاقد پلاسمید حذف گردند. دراین مورد، فقط بعضی آنتی بیوتیکها برای استفاده مناسب هستند. زیرا بعضی از آنتی بیوتیکها مصارف درمانی دارند و استفاده از ژن مقاومت به این آنتی بیوتیکها در پلاسمیدها جهت کلونیگ صحیح نمی‌باشد و همچنین بعضی سوش‌های E.coli مقاومت ذاتی به بعضی از آنتی بیوتیکها دارند بنابراین از ژن مقاومت به آن آنتی بیوتیک جهت غربالگری سلولهای ترانسفورم شده طی پروسه کلونینگ نمی توان استفاده نمود و باید ژنوتیپ سوش‌های مورد استفاده، قبل از پروسه کلونینگ بررسی گردد. قراردادن ژن مقاومت به آنتی بیوتیکها به عنوان مارکر انتخابی در وکتورها در مکانهای پائین دست پروموتر مناسب نیست. برای مثال قطع شدن ژن هدف هنگام قراردادن یک کاست مقاومت آنتی بیوتیکی موجب جهش ژن کلون شده می‌گردد و مقاومت آنتی بیوتیکی حاصل شده از دخول کاست بعنوان مارکری جهت شناسایی DNA جهش یافته استفاده می‌گردد. در مورد وکتورهایی که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پائین دست پروموتر تعبیه شده در صورت کلون شدن ژن در داخل وکتور، پلاسمید نوترکیب ایجاد شده توانایی انتقال مقاومت آنتی بیوتیکی به سلولهای ترانسفورم شده را نخواهد داشت. بسیاری ازجایگاههای کلونینگ (محل اثر آنزیم‌های محدودالاثر) در داخل ژن مقاومت آنتی بیوتیکی قرار دارند و هنگامی کهDNA هدف با ورود خود ناحیه کد کننده ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را قطع نماید، ژن مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک مربوطه بیان نخواهد شد که به این غیر فعال شدن در اثر ورود ژن خارجی، غیر فعال شدن تداخلی (Insert ional Inactivation) می گویند. از غیر فعال شدن تداخلی برای بررسی ورود یا عدم ورود ژن مورد نظر به داخل پلاسمید استفاده می‌شود. وکتورهای جدید، جایگاه‌های کلونینگ ویژه‌ای را دارا می‌باشند تا در هنگام کلونینگ DNA هدف عملکرد وکتور مختل نشود. بعضی وکتورهای پلاسمیدی ۲ شاخص مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک را دارا می‌باشند. برای مثال، پلاسمید pBR322 هم مقاومت آمپی سیلینی و هم تتراسیکلینی دارد که باعث جداسازی راحت کلنی‌های حاوی این پلاسمید می‌شود. مقاومت آنتی بیوتیکی متداول که در وکتورهای پلاسمیدیE. coli تعبیه می‌شوند عبارتند از: مقاومت به آمپی سیلین، کانامایسین، تتراسایکلین و کلرامفنیکل
5. سایت‌های کلونینگ چندتایی (MCS) : کلونینگ DNA داخل یک وکتور شامل اتصال قطعه‌ای از DNA هدف به DNA وکتور می‌باشد. این روند به وسیله قطعاتDNA ای که انتهاهای چسبناک دارند انجام می‌شود. بنابراین وکتور انتخابی باید دارای جایگاه اثر آنزیم محدود کننده‌ای باشد که قطعه DNA هدف توسط همان آنزیم محدود کننده ایجاد شده باشد. قطعات DNA با انتهاهای صاف می‌توانند به یکدیگر متصل شوند همینطور آنزیم‌های محدود کننده‌ای وجود دارند که بعد از برش DNA یک نوکلئوتید تنها در انتهای 3' ایجاد می‌نمایند که اصطلاحا به آن انتهای برجسته
می گویند. انتهاهای برجسته با برش نوکلئوتید اضافی می‌توانند تبدیل به انتهاهای صاف گردند. در بسیاری از وکتورهای قدیمی جایگاه‌های اثر اندونوکلئازهای محدودکننده در پلاسمید پراکنده‌اند و اغلب در میان یکی از ژن‌های وکتور وجود دارند. برای مثال بسیاری از جایگاه‌های کلونینگ در وکتورهای PACYC در داخل یکی از ژن‌های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی این پلاسمیدها قرار گرفته‌اند. کلون کردن در این جایگاه‌ها ژن مقاومت آنتی بیوتیکی را غیر فعال می‌کند و حساسیت بعدی به آنتی بیوتیک به عنوان غربالی برای پلاسمیدهای نوترکیب استفاده می‌شود. بیشتر وکتورهای جدید دارای یک رشته مصنوعی از DNA هستند که این رشته دارای تعداد زیادی سایت برش آنزیمی است و این جایگاه‌ها در هیچ جای دیگر پلاسمید وجود ندارد. این جایگاه‌های کلونینگ چند تایی یا پلی لینکرها انتخاب وسیعی از آنزیم‌های اندونوکلئاز را برای استفاده در مرحله کلونینگ امکان پذیر می‌سازند و همچنین سایت کلونینگ را به یک ناحیه کوچک از وکتور محدود می‌کنند. برای مثال MCSهای بسیاری از وکتورها مثلpUC به وسیله توالی‌هایی که مکمل یکسری پرایمرهای عمومی مثل پرایمر forwardو reverse متعلق به فاژ M13 است، احاطه شده‌اند. این جایگاه‌های priming به گونه‌ای هستند که امتداد پرایمرها را به این سایت‌ها متصل می‌کند و اجازه تعیین توالی هر دو انتهای یک DNA هدف را در MCS می‌دهند. بدین ترتیب می توان یکسری از پرایمرهای عمومی را برای تعیین توالی DNA هدف بدون در نظر گرفتن این که در کدام جایگاه از MCS کلون شده‌اند بکار برد. MCSهای بسیاری از پلاسمیدها با توالی کد کننده lacZ همپوشانی دارند. در صورت کلون شدن ژن هدف در حایگاه کلونینگ اینگونه پلاسمیدها، ژن lacZ غیر فعال شده و با استفاده از غربالگری سفید-آبی می‌توان سلولهای حاوی پلاسمید نوترکیب را تمیز داد.
وکتورهای بیانگر
pGEX یکی از انواع وکتور های بیانگر که برای بیان پروتئین ها در باکتری بکار می‌رود. این وکتور باعث اتصال یک برچسب GST به پروتئین می‌شود.
وکتورهای بیانگر، علاوه بر نگهداری و تکثیر قطعات DNA برای بیان ژنها به کار برده می‌شوند. وکتورهای مزبور دارای پروموترهای مناسب، جایگاه اتصال ریبوزوم (RBS)، کدون آغاز ترجمه و توالی پایان رونویسی می‌باشند که در فاصله معینی در اطراف ژن کلون شده قرار گرفته و ایجاد یک قاب خواندن (ORE) مناسب برای ژن می‌نمایند. به ناحیه‌ای که این اجزا را در برمی گیرد کاست گفته می‌شود.
وکتورهای یوکاریوتی و پروکاریوتی
بسته به نوع میزبانی که ژن مورد نظر در آن تکثیر و یا بیان می‌شود، نوع وکتور و پروموتر به کار رفته متفاوت خواهد بود. خصوصیات عمومی وکتورهای یوکاریوتی و پروکاریوتیمشابه‌است. اما این وکتورها در برخی خواص با هم تفاوت دارند. جایگاه‌های آغاز همانند سازی، رونویسی و توالیهای تنظیمی هر وکتور باید بگونه‌ای باشد که برای سیستم آنزیمی میزبان قابل شناسایی باشد. به عبارتی دیگر جایگاه اتصال ریبوزوم (RBS) وکتورهای بیان ژن یوکاریوتی، توسط ریبوزومهای یوکاریوتی و RBSهای پروکاریوتی توسط ریبوزومهای پروکاریوتی شناسایی می‌شوند.
وکتور عاملی است که می‌تواند یک قطعه DNA را به سلول میزبان انتقال دهد. اگر برای تولید و تکثیر DNA به کار رود، کلونینگ وکتور نامیده می‌شود. در واقع یک وکتور کلونینگ، یک ناقل کوچک DNA است که در داخل خود یک قطعه DNA خارجی را می‌تواند حمل کند. قراردادن یک قطعه از DNA در یک وکتور کلونینگ به وسیله تیمار وکتور و DNA خارجی با آنزیم‌های محدودکننده یکسان امکانپذیر می‌باشد. بدین ترتیب می توان قطعات ایجاد شده را به یکدیگر متصل نمود.
وکتورهای کلونینگ ۳ جز مهم را دارا می‌باشند:
1) یک مبداء همانند سازی
2) ژن مارکر انتخابی (برای مثال ژن مقاومت به Amp)
3) چندین سایت کلونینگ که محل برش به وسیله آنزیم‌های محدودالاثر هستند.
یک مولکول DNA برای آن که بتواند به عنوان یک وکتور کلونینگ عمل کند باید چند ویژگی داشته باشد: اولین و مهم‌ترین ویژگی آن است که بتواند در سلول میزبان همانند سازی کند. بنابراین توسط آن کپی‌های متعددی از مولکولDNA نوترکیب ایجاد می‌شود و به سلولهای دختری منتقل می‌گردد. یک وکتور کلونینگ باید نسبتا کوچک باشد و اندازه آن کمتر از kb10باشد زیرا مولکول‌های بزرگ در حین تخلیص شکسته می‌شوند و همچنین دستکاری و تغییر دادن آنها مشکل تر است. دو نوع مولکول DNA که این ویژگی‌ها را دارد در سلولهای باکتریایی یافت می‌شود: کروموزوم‌های باکتریوفاژی و پلاسمیدی.
اگر چه پلاسمیدها غالبا به عنوان وکتورهای کلونینگ استفاده می‌شوند، دو نوع از تیپ‌های مهم وکتوری که امروزه کاربرد دارند از باکتریوفاژها مشتق شده‌اند.
معیارهای انتخاب یک وکتور کلونینگ
1. اندازه DNA قرار گرفته در وکتور: برای پروژه‌هایی که در آنها هدف کلون کردن قطعه ویژه‌ای از DNA است باید سایز DNA قرار گرفته در وکتور مناسب باشد. بیشتر پلاسمیدها می‌توانند DNA ای تا حد kb 15 را با خود حمل کنند. قرار دادنDNA بزرگتر در وکتور، مانع همانند سازی مناسب پلاسمیدها می‌شود (مخصوصا برای وکتورهای با رونوشت بالا). همچنین مشکلاتی برای پایداری DNA درج شده در پلاسمید ایجاد می‌گردد. برای کلون کردن قطعات بزرگ DNA انواع دیگری از وکتورها موجود هستند. این وکتورها برای ایجاد خزانه‌های DNA استفاده می‌شوند. این وکتورها از مجموعه‌ای از وکتورهای نوترکیب تشکیل شده‌است که طبق اصول کلون کردن بدست آمده‌اند. یک خزانه DNA از قطعات حاصل از برش ژنوم کامل یک موجود به وسیله آنزیم‌های اندونوکلئاز تشکیل شده‌است. کلنی‌های حاوی قطعات ژنتیکی جدا می‌شوند و از نظر وجود ژن‌های مورد نظر بررسی شده و کلنی حاوی ژن مورد نظر انتخاب می‌گردد.
2. تعداد رونوشت: وکتورهای کلونینگ مختلف بسته به واحد همانند سازی (رپلیکون) پلاسمید، تعداد کپی‌های متفاوتی دارند. پلاسمیدهای با منشاء Col E1، 15-20 کپی دارند. اما یک رپلیکون Col E1 جهش یافته همانند پلاسمیدهای سری pUC 700 ، 500 کپی دارد. این کپی‌ها در نتیجه یک جهش نقطه‌ای در مولکول تنظیمی RNA ІІایجاد می‌شوند که آن را نسبت به مهار یا RNAІ مقاوم تر می‌کند. هم چنین این جهش باعث حساسیت به دما می‌شود، به طوری که RNA ІІ جهش یافته نسبت به مهار باRNA І در دمای ˚۳۷ و ˚۴۲ مقاوم است اما در˚۳۰ مقاوم نیست. در این دما کپی پلاسمیدهای Col E1 غیرجهش یافته باز می‌گردد. در بعضی موارد یک کپی بالا ممکن است برای کلونینگ DNA مشکل ایجاد کند. برای مثال، DNA کلون شده ممکن است پروتئین‌هایی را کد کند که در مقادیر بالا برای سلول توکسیک باشند. حتی اگر پروتئینی از DNA کلون شده در سطح پائینی بیان شود، وجود کپی‌های زیاد از ژن داخل پلاسمید ممکن است سطح پروتئین را تا حد سمیت بالا ببرد. در این موارد استفاده از پلاسمیدهایی با تعداد کپی پایین تر می‌تواند سطح پروتئین را تا زیر حد سمیت کاهش دهد. برای مثال pBR322 دارای رپلیکون Col E1 هستند و بنابراین 15-20 رونوشت دارند. پلاسمیدهای سری PACY دارای رپلیکون P15A هستند که 18-22 رونوشت دارد. پلاسمیدهای با رونوشت پایین شامل pSC101 و BACS به ترتیب ۵ و ۱رونوشت دارند.
3. ناسازگاری: اگر ۲ یا چند نوع از پلاسمیدها نتوانند با هم در یک سلول میزبان وجود داشته باشند، گفته می‌شود که آنها به یک گروه ناسازگاری تعلق دارند.اما پلاسمیدهایی از گروه‌های ناسازگاری متفاوت می‌توانند با هم در یک سلول حفظ شوند. این اتفاق زمانی رخ می‌دهد که ۲ پلاسمید مختلف، حداقل از یک جز عملکردی مشترک برای همانند سازی و پارتیشن بندی جهت تقسیم سلولی استفاده نمایند. بنابراین رقابت برای استفاده ار اجزا عملکردی مشترک در سلول بوجود می‌آید و طبق مکانیسم انتخاب طبیعی پلاسمید غالب در سلول باقی مانده و پلاسمید دیگر حذف می‌گردد. سایز پلاسمید نیز در حفظ آن در روند کشت اثر می‌گذارد. به طوری که پلاسمیدهای بزرگ تر زمان طولانی تری برای همانندسازی نیاز دارند و توسط پلاسمیدهای کوچکتر که سریع تر همانندسازی می‌کنند از سلول حذف می‌شوند.
4. مارکر انتخابی: وارد کردن پلاسمیدها به سلولهای E.coli فرایند کارآمدی نیست. زیرا بسیاری از کلنی‌های حاصل فاقد مولکول پلاسمید بوده و تمیز دادن آنها از کلنی‌های دارای پلاسمید کاری بس دشوار می‌باشد. به علاوه سلولهای فاقد پلاسمید نسبت به سلولهای دارای پلاسمید رشد بهتری دارند. بعلت همانندسازی همزمان DNAکروموزومی و پلاسمید وارد شده در سلولهای دارای پلاسمید، این سلولها انرژی بیشتری را صرف تکثیر نموده و مسلما رشد کمتری خواهند داشت. بخصوص زمانی که پلاسمیدهای بزرگ و یا پلاسمیدهایی با تعداد رونوشت بالا در سلول وارد شده باشد. بنابراین روشی برای انتخاب کلنی‌های دارای پلاسمید مورد نیاز است. این امکان همیشه با حضور یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پلاسمید، فراهم می‌شود. اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت موجب می‌شود تنها سلول‌هایی که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک مربوطه را به دلیل حضور یک پلاسمید نوترکیب بیان می‌کنند، زنده بمانند و رشد کنند و سلولهای فاقد پلاسمید حذف گردند. دراین مورد، فقط بعضی آنتی بیوتیکها برای استفاده مناسب هستند. زیرا بعضی از آنتی بیوتیکها مصارف درمانی دارند و استفاده از ژن مقاومت به این آنتی بیوتیکها در پلاسمیدها جهت کلونیگ صحیح نمی‌باشد و همچنین بعضی سوش‌های E.coli مقاومت ذاتی به بعضی از آنتی بیوتیکها دارند بنابراین از ژن مقاومت به آن آنتی بیوتیک جهت غربالگری سلولهای ترانسفورم شده طی پروسه کلونینگ نمی توان استفاده نمود و باید ژنوتیپ سوش‌های مورد استفاده، قبل از پروسه کلونینگ بررسی گردد. قراردادن ژن مقاومت به آنتی بیوتیکها به عنوان مارکر انتخابی در وکتورها در مکانهای پائین دست پروموتر مناسب نیست. برای مثال قطع شدن ژن هدف هنگام قراردادن یک کاست مقاومت آنتی بیوتیکی موجب جهش ژن کلون شده می‌گردد و مقاومت آنتی بیوتیکی حاصل شده از دخول کاست بعنوان مارکری جهت شناسایی DNA جهش یافته استفاده می‌گردد. در مورد وکتورهایی که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پائین دست پروموتر تعبیه شده در صورت کلون شدن ژن در داخل وکتور، پلاسمید نوترکیب ایجاد شده توانایی انتقال مقاومت آنتی بیوتیکی به سلولهای ترانسفورم شده را نخواهد داشت. بسیاری ازجایگاههای کلونینگ (محل اثر آنزیم‌های محدودالاثر) در داخل ژن مقاومت آنتی بیوتیکی قرار دارند و هنگامی کهDNA هدف با ورود خود ناحیه کد کننده ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را قطع نماید، ژن مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک مربوطه بیان نخواهد شد که به این غیر فعال شدن در اثر ورود ژن خارجی، غیر فعال شدن تداخلی (Insert ional Inactivation) می گویند. از غیر فعال شدن تداخلی برای بررسی ورود یا عدم ورود ژن مورد نظر به داخل پلاسمید استفاده می‌شود. وکتورهای جدید، جایگاه‌های کلونینگ ویژه‌ای را دارا می‌باشند تا در هنگام کلونینگ DNA هدف عملکرد وکتور مختل نشود. بعضی وکتورهای پلاسمیدی ۲ شاخص مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک را دارا می‌باشند. برای مثال، پلاسمید pBR322 هم مقاومت آمپی سیلینی و هم تتراسیکلینی دارد که باعث جداسازی راحت کلنی‌های حاوی این پلاسمید می‌شود. مقاومت آنتی بیوتیکی متداول که در وکتورهای پلاسمیدیE. coli تعبیه می‌شوند عبارتند از: مقاومت به آمپی سیلین، کانامایسین، تتراسایکلین و کلرامفنیکل
5. سایت‌های کلونینگ چندتایی (MCS) : کلونینگ DNA داخل یک وکتور شامل اتصال قطعه‌ای از DNA هدف به DNA وکتور می‌باشد. این روند به وسیله قطعاتDNA ای که انتهاهای چسبناک دارند انجام می‌شود. بنابراین وکتور انتخابی باید دارای جایگاه اثر آنزیم محدود کننده‌ای باشد که قطعه DNA هدف توسط همان آنزیم محدود کننده ایجاد شده باشد. قطعات DNA با انتهاهای صاف می‌توانند به یکدیگر متصل شوند همینطور آنزیم‌های محدود کننده‌ای وجود دارند که بعد از برش DNA یک نوکلئوتید تنها در انتهای 3' ایجاد می‌نمایند که اصطلاحا به آن انتهای برجسته
می گویند. انتهاهای برجسته با برش نوکلئوتید اضافی می‌توانند تبدیل به انتهاهای صاف گردند. در بسیاری از وکتورهای قدیمی جایگاه‌های اثر اندونوکلئازهای محدودکننده در پلاسمید پراکنده‌اند و اغلب در میان یکی از ژن‌های وکتور وجود دارند. برای مثال بسیاری از جایگاه‌های کلونینگ در وکتورهای PACYC در داخل یکی از ژن‌های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی این پلاسمیدها قرار گرفته‌اند. کلون کردن در این جایگاه‌ها ژن مقاومت آنتی بیوتیکی را غیر فعال می‌کند و حساسیت بعدی به آنتی بیوتیک به عنوان غربالی برای پلاسمیدهای نوترکیب استفاده می‌شود. بیشتر وکتورهای جدید دارای یک رشته مصنوعی از DNA هستند که این رشته دارای تعداد زیادی سایت برش آنزیمی است و این جایگاه‌ها در هیچ جای دیگر پلاسمید وجود ندارد. این جایگاه‌های کلونینگ چند تایی یا پلی لینکرها انتخاب وسیعی از آنزیم‌های اندونوکلئاز را برای استفاده در مرحله کلونینگ امکان پذیر می‌سازند و همچنین سایت کلونینگ را به یک ناحیه کوچک از وکتور محدود می‌کنند. برای مثال MCSهای بسیاری از وکتورها مثلpUC به وسیله توالی‌هایی که مکمل یکسری پرایمرهای عمومی مثل پرایمر forwardو reverse متعلق به فاژ M13 است، احاطه شده‌اند. این جایگاه‌های priming به گونه‌ای هستند که امتداد پرایمرها را به این سایت‌ها متصل می‌کند و اجازه تعیین توالی هر دو انتهای یک DNA هدف را در MCS می‌دهند. بدین ترتیب می توان یکسری از پرایمرهای عمومی را برای تعیین توالی DNA هدف بدون در نظر گرفتن این که در کدام جایگاه از MCS کلون شده‌اند بکار برد. MCSهای بسیاری از پلاسمیدها با توالی کد کننده lacZ همپوشانی دارند. در صورت کلون شدن ژن هدف در حایگاه کلونینگ اینگونه پلاسمیدها، ژن lacZ غیر فعال شده و با استفاده از غربالگری سفید-آبی می‌توان سلولهای حاوی پلاسمید نوترکیب را تمیز داد.
وکتورهای بیانگر
pGEX یکی از انواع وکتور های بیانگر که برای بیان پروتئین ها در باکتری بکار می‌رود. این وکتور باعث اتصال یک برچسب GST به پروتئین می‌شود.
وکتورهای بیانگر، علاوه بر نگهداری و تکثیر قطعات DNA برای بیان ژنها به کار برده می‌شوند. وکتورهای مزبور دارای پروموترهای مناسب، جایگاه اتصال ریبوزوم (RBS)، کدون آغاز ترجمه و توالی پایان رونویسی می‌باشند که در فاصله معینی در اطراف ژن کلون شده قرار گرفته و ایجاد یک قاب خواندن (ORE) مناسب برای ژن می‌نمایند. به ناحیه‌ای که این اجزا را در برمی گیرد کاست گفته می‌شود.
وکتورهای یوکاریوتی و پروکاریوتی
بسته به نوع میزبانی که ژن مورد نظر در آن تکثیر و یا بیان می‌شود، نوع وکتور و پروموتر به کار رفته متفاوت خواهد بود. خصوصیات عمومی وکتورهای یوکاریوتی و پروکاریوتیمشابه‌است. اما این وکتورها در برخی خواص با هم تفاوت دارند. جایگاه‌های آغاز همانند سازی، رونویسی و توالیهای تنظیمی هر وکتور باید بگونه‌ای باشد که برای سیستم آنزیمی میزبان قابل شناسایی باشد. به عبارتی دیگر جایگاه اتصال ریبوزوم (RBS) وکتورهای بیان ژن یوکاریوتی، توسط ریبوزومهای یوکاریوتی و RBSهای پروکاریوتی توسط ریبوزومهای پروکاریوتی شناسایی می‌شوند.