تکنیک PCR در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مـولـکـول DNA مـیـلـیـونـهـا بار تـکثـیـر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انـجـام مـیـدهـد. DNA پـلـیـمـراز آنـزیـمـی اسـت کـه بـا اسـتـفـاده از نـوکـلـئـوتیدها (مصالح سـاخـتـمـانـیDNA)، رشـتـه الـگـو(DNAی مـورد مـطـالـعـه) و یـک قـطعـه پرایمر قادر بههمانند سازی است. صحتنتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی وبرنامه ریزی شده، روند PCR تکـرار گـردیـده و در هـر مـرحـلـه DNA دو بـرابـر مـیـشـود. بنابراین تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت ۲[SUP]n[/SUP] افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکولDNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود.
در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفتTaq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید.امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن
است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهاPCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb 40 را هم میتوان تکثیر کرد.
محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است:
۱) DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد.
۲) پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNA باشد.
۳) Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰ درجه سانتیگراد باشد.
۴) دئوکسی نوکلئوئید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند.
۵) محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.
۶) کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز
۷) کاتیون یکظرفیتی: یون پتاسیممحلولPCR معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک ۰.۲ تا ۰.۵ میلی لیتر تهیه میشود. این لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند.
ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود.در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار میشود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود. دمای لوله ها و فواصل زمانی هم تابع عوامل مختلفی است از جمله : نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز،غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها.
در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفتTaq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید.امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن
است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهاPCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb 40 را هم میتوان تکثیر کرد.
محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است:
۱) DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد.
۲) پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNA باشد.
۳) Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰ درجه سانتیگراد باشد.
۴) دئوکسی نوکلئوئید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند.
۵) محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.
۶) کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز
۷) کاتیون یکظرفیتی: یون پتاسیممحلولPCR معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک ۰.۲ تا ۰.۵ میلی لیتر تهیه میشود. این لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند.
ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود.در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار میشود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود. دمای لوله ها و فواصل زمانی هم تابع عوامل مختلفی است از جمله : نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز،غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها.