كشت بافت

["Pejman"]

تكثير خرما به روش كشت بافت

كشت بافت گياهي عبارت است از تكنيكي كه براي توليد و تكثير گياه كامل از بخش هايي مانند سلول يا بافت گياه استفاده مي شود . اين نوع تكثير موسوم به تكثير خرد يا ريزازديادي بوده و با دو روش توليد گياهك از طريق اندام زائي و جنين رويشي يا گياهك زائي امكان پذير مي باشد . در هر دو روش وجود يك محيط آزمايشگاهي استريل و استفاده از هواي تصفيه شده الزامي است . خوشبختانه در سال هاي اخير تكنولوژي توليد نهال كشت بافت خرما به كشور وارد شده و به حالت بومي درآمده است .

فوائد تكثير خرما به روش كشت بافت

1) درختان خرماي حاصل از كشت بافت كاملاً شبيه به والدين مي باشد(True To Type) بنابراين كليه صفات والد نظير مقدار محصول؛ وضعيت رشد؛ مقاومت به بيماري و آفات به گياهان توليد شده منتقل مي شود .
2) امكان توليد انبوه نهال شبيه به گياه مادري وجود دارد .
3) واريته هاي كمياب خرما را مي توان در مقياس وسيع توليد كرد .
4) تكثير نخل خرما به روش كشت بافت را مي توان در هر زمان و هر فصل انجام داد بنابراين تحت تاثير شرايط فصلي نمي باشد .
5) مدت زمان توليد نهال به حد قابل ملاحظه اي كاهش مي يابد .
6) امكان توليد ارقام ماده برتر و سالم ؛ واريته هاي مقاوم به بيماري ؛شوري و تنش هاي محيطي و همچنين توليد انبوه پايه هاي نر پرگرده با ويژگي هاي متازنيايي مطلوب وجود دارد .
7) نهال كشت بافت داراي سيستم ريشه ي توسعه يافته مي باشد بنابراين درصد بقاء آنها در مزرعه حدود 100% است.
8) نهال كشت بافت در هرزمان از سال قابل كاشت در زمين اصلي مي باشد .
9) هويت نهال حاصل از كشت بافت مشخص و تضمين شده است .
10) انتقال نهال راحت تر و هزينه آن كمتر است .
11) بدليل استفاده از گياهان بدون آلودگي ؛ خطر انتشار آفات و بيماري هاي نخل از يك منطقه به منطقه ديگر وجود ندارد و يا بسيار نادر است .
12) گياهان حاصل از كشت بافت ؛ باغات يك دست از نظر ساختار ژنتيكي و ظاهري؛ رشد سريع و ثمردهي زود هنگام را توليد مي كنند .
لازم به ذكر است كه عملكرد ؛ كيفيت و وضعيت رشد ارقام مختلف خرما در مناطق خرماخيز كشور متفاوت است . اين تاثير مربوط به ارتفاع منطقه از سطح دريا؛ نوسانات دمايي منطقه؛ رطوبت نسبي محيط و ساير عوامل محيطي مي باشد بطوريكه كشت برخي از ارقام در بعضي از مناطق اصلاً توصيه نمي شود . به عنوان مثال رقم پيارم در مناطقي كه از سطح دريا بالاتر باشند توليد ميوه با كيفيت بهتر مي كند حال آنكه رقم شهابي بدليل سازگاري با شرايط مرطوب مناطق ساحلي و توليد محصول خوب در اين مناطق توصيه مي شود
در حال حاضر با توجه به مناسب بودن ارقام خشك و نيمه خشك خرما ( ارقامي كه ميوه آن در زمان رسيدن داراي 12% تا 15% رطوبت باشد ) جهت فرآوري ؛ بسته بندي ؛ انبارداري مدت دار و صادرات ؛ توليد ارقام يادشده بيشتر رايج است . با بررسي هاي انجام شده و تحقيق بر ارقام مختلف تجاري خرما در ايران ؛ ارقام سازگار با هر كدام از استان هاي خرماخيز كشور به قرار زير مي باشد :

ارقام سازگار خرما قابل توصيه جهت توسعه نخيلات در استان هاي خرماخيز كشور
استان
ارقام خرماي سازگار با منطقه
بوشهر
زاهدي ؛ شهابي ؛ خاصوئي ؛ برحي ؛ مجول
خوزستان
استعمران ؛ برحي ؛ زاهدي ؛ ديري ؛ خاصوئي ؛ خلاص ؛ حلاوي ؛ بريم ؛ مجول
كرمان
پيارم ؛ زاهدي ؛ مجول
فارس
پيارم ؛ زاهدي
هرمزگان
پيارم ؛ زاهدي ؛ ديري ؛ خاصوئي ؛ برحي ؛ خلاص ؛ توري ؛ مجول
جيرفت و كهنوج
پيارم ؛ زاهدي ؛ استعمران ؛ ديري ؛ توري ؛ مجول
سيستان و بلوچستان
پيارم ؛ زاهدي ؛ ربي ؛ استعمران
يزد
پيارم ؛ زاهدي ؛ كبكاب ؛ بريم ؛ خلاص
اصفهان
خلاص ؛ برحي
سمنان
زاهدي ؛ برحي
خراسان جنوبي
زاهدي ؛ كبكاب
كرمانشاه
زاهدي ؛ اشرسي
ايلام
زاهدي ؛ اشرسي ؛ استعمران
​

مراحل مختلف رشدي نهال هاي كشت بافت خرما و گلدان هاي مناسب جهت نگهداري آن:

1) گلدان تورپيدو يا اژدري A2:

گلدان هايي از جنس پلي اتيلن سياه رنگ كه بدليل شكل مخروطي و نداشتن سطح اتكا بصورت باكس هاي 9 و 25 تايي به بازار عرضه مي شود . اين گلدان براي نگهداري نهال هاي كشت بافت خرما بعد از خروج از محيط رشد درون شيشه در آزمايشگاه تا زمان توليد 6-5 برگ و افزايش ارتفاع مطلوب حدود 50-40 سانتيمتر مورد استفاده قرار مي گيرد .
اين شرايط بعد از گذشت 6 -4 ماه از زمان نگهداري نهال هاي درون گلدان اژدري در گلخانه سازگاري قابل مشاهده مي باشد .

2) گلدان پلاستيكي 3 ليتري B1 :

گلدان ها از جنس پلاستيك با رنگ هاي متنوع و حجم 3 ليتر ( ارتفاع 18 سانتيمتر و قطر 12 سانتيمتر ) مي باشند كه براي نگهداري نهال هاي رشد كرده و داراي 5-4 برگ با ارتفاع 50-40 سانتيمتر مناسب مي باشد . با توجه به رشد نسبي مناسب در اين مرحله ؛ درصورت وجود شرايط مناسب كشت در منطقه نظير عدم تابش شديد آفتاب و وزش بادهاي گرم و خشك و آبياري كافي ؛ قابل انتقال و كشت در زمين اصلي مي باشد . اين نهال بعد از 4-3 سال در صورت اعمال مراقبت هاي لازم به بار خواهد نشست .

3) گلدان پلاستيكي 8 ليتري B2 :

گلدان ها از جنس پلي اتيلن حجم 8 ليتر ( ارتفاع 28 سانتيمتر و قطر 20 سانتيمتر ) مي باشند كه براي نگهداري نهال هاي رشد كرده و داراي 6-5 برگ اصلي با طوقه كاملاً مشخص و ارتفاع 80-60 سانتيمتر مناسب مي باشد . با توجه به رشد مناسب نهال در اين مرحله ؛ درصورت وجود شرايط مناسب كشت در منطقه ؛ قابل انتقال و كشت در زمين اصلي مي باشد . اين نهال بعد از 3-2 سال در صورت اعمال مراقبت هاي لازم به بار خواهد نشست .

4) گلدان پلاستيكي 20 ليتري C1 :

گلدان هايي از جنس پلي اتيلن با حجم 20 ليتر مي باشند كه براي نگهداري نهال هاي رشد كرده و داراي 9-6 برگ اصلي با طوقه كاملاً مشخص و ارتفاع 100-80 سانتيمتر مناسب مي باشد . با توجه به رشد نهايي نهال جهت نگهداري در گلدان نهال در اين مرحله قابل انتقال و كشت در زمين اصلي مي باشد . اين نهال بعد از 2 سال به بار خواهد نشست .
خصوصيات و نکات قابل توجه در گلخانه سازگاري

1 ) کنترل دما

• <LI class=MsoNormal dir=rtl style="TEXT-JUSTIFY: kashida; MARGIN: 0cm 36pt 0pt 0cm; DIRECTION: rtl; unicode-bidi: embed; TEXT-ALIGN: justify; TEXT-KASHIDA: 0%; mso-list: l1 level1 lfo3; tab-stops: list 36.0pt">نگه داشتن دما در حدود 30 درجه سانتيگراد (12 درجه سانتيگراد نقطه خطر و ماکزيمم درجه حرارت 35 درجه سانتيگراد).
• استفاده از آبياري کف گلخانه در هنگام وقوع افزايش دما . براي اين منظور مي توان از سيستم ميست يا پاشيدن دستي آب توسط شيلنگ روي كف بتوني يا راهروهاي گلخانه استفاده نمود

2 ) ممانعت از تابش مستقيم نور خورشيد به روش ذيل :

• استفاده از تکنيک سايه دهي يا رنگ پاشي بوسيله حصير يا برگ هاي خشک نخل براي جلوگيري از افزايش دما و تابش مستقيم نور آفتاب خصوصاً در فصل بهار و تابستان .

(براي اين منظور سطح رويي گلخانه توسط حصير چوبي يا برگ نخل بطوركامل پوشيده مي شود . اين حالت پاعث ايجاد سايه و عدم تابش مستقيم نور خورشيد به گياهان مي شود و نور عبور كرده از حصير و درزهاي آن كافي خواهد بود )


3 ) کنترل رطوبت :

• <LI class=MsoNormal dir=rtl style="TEXT-JUSTIFY: kashida; MARGIN: 0cm 36pt 0pt 0cm; DIRECTION: rtl; unicode-bidi: embed; TEXT-ALIGN: justify; TEXT-KASHIDA: 0%; mso-list: l4 level1 lfo2; tab-stops: list 36.0pt">نصب رطوبت سنج در گلخانه به منظور اطلاع از ميزان رطوبت نسبي محيط گلخانه <LI class=MsoNormal dir=rtl style="TEXT-JUSTIFY: kashida; MARGIN: 0cm 36pt 0pt 0cm; DIRECTION: rtl; unicode-bidi: embed; TEXT-ALIGN: justify; TEXT-KASHIDA: 0%; mso-list: l4 level1 lfo2; tab-stops: list 36.0pt">حفظ رطوبت در دامنه 60 -50 درصد نسبي <LI class=MsoNormal dir=rtl style="TEXT-JUSTIFY: kashida; MARGIN: 0cm 36pt 0pt 0cm; DIRECTION: rtl; unicode-bidi: embed; TEXT-ALIGN: justify; TEXT-KASHIDA: 0%; mso-list: l4 level1 lfo2; tab-stops: list 36.0pt">استفاده از دستگاه هاي رطوبت زا يا آبپاشي سطح گلخانه جهت بالابردن رطوبت نسبي فضاي گلخانه ها.
• کنترل افزايش بيش از حد رطوبت بوسيله هوادهي گلخانه جهت جلوگيري از شيوع امراض قارچي

( با نصب دستگاه رطوبت سنج مجهز به كليد قطع و وصل كننده سيستم ميست و هواكش مي توان تنظيمات را بصورتي اعمال نمود كه با كاهش ميزان رطوبت محيط از مرز 45% سيستم ميست شروع بكار كرده و در مواقعي كه رطوبت از 70% فراتر رود سيستم تهويه ( هواكش) جهت خارج نمودن رطوبت اضافه محيط روشن گردد )

4 ) مبارزه با بيماريها و آفات

سمپاشي دوره اي هر 2 هفته يکبار با قارچ کش و حشره کش هاي معمول در بازار نظير بنوميل يا مانكوزب با غلظت 2 در هزار مناسب جهت پيشگيري. 5 ) پوشش کف گلخانه

• استفاده از سطح بتوني با پوشش شن به قطر متوسط 5 سانتيمتر جهت ممانعت از رشد و ورود ريشه به خاک زيرين گلدان ضروري است.

نكته:
1) درصورت عدم انجام بتون ريزي، استفاده از گوني ضخيم پلاستيکي بر روي پوشش شني به جاي سطح بتوني الزامي مي باشد.

2) در صورت عدم رعايت موارد فوق ‌ريشه نهال به خاك كف گلخانه نفوذ كرده و در هنگام جابجايي نهال بدليل قطع شدن قسمت اصلي ريشه ضمن وارد آمدن استرس به گياه احتمال خشك شدن آن پس از كاشت در زمين اصلي بسيار افزايش مي يابد

 

["Pejman"]

وقتی درباره کشت گیاه صحبت می‌شود، معمولا منظور کشت گیاهان در گلدان ، زیر پلاستیک (Frames) ، در گلخانه و یا مزرعه است. در تقسیم بندیهای رایج در کشاورزی ، کشت گیاهان به بخشهای مختلف شامل زراعت ، باغبانی ، زراعت مناطق گرمسیری ، جنگل‌داری و اصلاح نباتات تقسیم می‌گردد. در سال 1904 هانیگ ، روش جدیدی از کشت گیاهان به نام کشت جنین را ارائه نمود.

او جنین نابالغ تعداد زیادی از گیاهان تیره شب‌بو (cruci Ferae) را در شرایط کشت آزمایشگاهی (in Vitro) ایزوله کرد و از آنها ، گیاهچه‌های زنده بدست آورد. از سال 1920 انواع روشهای کشت بافت ، نظیر کشت آزمایشگاهی بذرهای ارکیده ، کشت کالوس ، کشت اندام مرسوم شد. بعد از سال 1945 ، به تمام روشهای مختلف کشت در آزمایشگاه ، کشت بافت گیاهی اطلاق گردید.

انواع کشت بافت

• کشت گیاه کامل: یک بذر ممکن است در شرایط آزمایشگاهی کشت شود و یک گیاهچه و در نهایت یک گیاه کامل تولید کند.
• کشت جنین: در این نوع کشت ، جنین جدا شده و پس از حذف پوسته بذر ، کشت می‌شود.
• کشت اندام گیاهی: در این کشت ، انواع مختلفی مثل کشت مریستم ، کشت ریشه ، کشت نوک ساقه قابل تشخیص هستند.
• کشت کالوس: اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در شرایط آزمایشگاهی تولید یک توده سلولی تمایز نیافته به نام کالوس نماید، این پدیده را کشت کالوس می‌نامند.
• کشت سلول: کشت سلولهای منفرد که به کمک آنزیمها یا به روشهای مکانیکی از یک بافت گیاهی یا سوسپانسیون سلولی بدست می‌آیند.
• کشت پروتوپلاست: کشت پروتوپلاستهایی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلولی بوجود آمده‌اند، کشت پروتوپلاست نام دارد.

موارد کاربرد کشت جنین

• رفع موانع جوانه‌زنی بذر: در تعدادی از گونه‌های گیاهی ، جوانه زنی در شرایط خارج آزمایشگاه ، مطلقا امکان‌پذیر نیست. در این مورد استفاده از کشت جنین ، ضروری است.
• کوتاه کردن دوره اصلاح نبات: در تعدادی از گونه‌های گیاهی، خواب بذر وجود دارد که اغلب به علت پوسته بذر و یا آندوسپرم است. با حذف پوسته بذر ، جوانه‌زنی بلافاصله صورت می‌گیرد.
• جلوگیری از سقط جنین در درختان هسته‌دار زود رس.
• جلوگیری از سقط جنین در اثر ناسازگاری.
• تکثیر رویشی: مثلا در تیره گندم و راسته کاج ، از جنین به عنوان یک ماده اولیه برای تکثیر رویشی ، استفاده می‌شود.

تولید گیاهان عاری از ویروس

مبارزه با آلودگیهای داخلی که بوسیله ویروسها ، مایکوپلاسماها و قارچهای میکروسکوپی ایجاد می‌شود، بسیار مشکل می‌باشد. برخلاف آنچه که قبلا تصور می‌شد، ویروسها می‌توانند طی تکثیر جنسی نیز منتقل شوند. حداقل 80 نوع از ویروسهای گیاهی می‌توانند از طریق بذر منتقل شوند. ویروسها باعث کاهش عملکرد و همچنین کاهش کیفیت تولیدات گیاهی می‌شوند.

بنابراین بسیار مهم است که مواد اولیه‌ای که برای تکثیر رویشی استفاده می‌شوند، عاری از ویروس باشند. پنج روش برای تولید گیاهان عاری از ویروس وجود دارد. استفاده از گرما ، کشت مریستم ، استفاده از گرما و سپس کشت مریستم ، تشکیل اندام هوایی نابجا و سپس کشت مریستم و پیوند مریستم روی پایه‌های عاری از ویروس که به آن ریز پیوندی نیز گفته می‌شود.

تولید گیاهان عاری از باکتری و قارچ بوسیله کشت مریستم

به نظر می‌رسد که تولید گیاهان عاری از باکتری و قارچ نیز بوسیله کشت مریستم امکان‌پذیر است. مهمترین جنسهای باکتری که بایستی حذف شوند، عبارتند از: Erwinia ، Pseudomonas و Bacillus و مهمترین جنس قارچها عبارتند از: Fusarium ، verticillium و Rhizoctonia. گاهی اوقات برای تعیین این که آیا گیاه عاری از باکتری یا قارچ است، یک محیط کشت غنی ، بکار می‌رود. اولین تحقیق از کشت مریستم میخک برای تولید گیاهان عاری از قارچ انجام گرفت. کشت مریستم بطور موفقیت آمیزی برای حذف باکتری Xanthomonas در گیاه بگونیا ، صورت گرفته است.

دست ورزی ژنتیکی

تا سال 1970 انتقال مواد ژنتیکی از یک موجود به موجود دیگر در گیاهان عالی فقط از طریق جنسی بوسیله استخراج سلول تخمزا با هسته زایشی دانه گرده امکان داشت که حاصل آن تخم بارور بود که می‌توانست از آن موجودی با خصوصیات پدری و مادری بوجود آید. انتقال مواد ژنتیکی به صورت غیر جنسی ، فقط از طریق استفاده از پروتوپلاست ، امکان‌پذیر است. دست ورزی ژنتیکی یک روش ژنتیک مولکولی انتقال مواد ژنتیکی از سلول (پروتوپلاست) دیگر در شرایط آزمایشگاهی بدون توجه به مرحله زایشی می‌باشد. انواع روشهای دست ورزی ژنتیکی شامل دو رگه‌گیری سوماتیکی ، دو رگه سیتوپلاسمی ، جذب و جابجایی هسته‌های ایزوله شده و کروموزومها و انتقال ژنتیکی.

بیوسنتز مواد در آزمایشگاه

مدت زمان طولانی است که در صنعت از کشت میکروارگانیسمها مثل پنی‌سیلیوم و استرپتوماسیس برای بدست آوردن موادی مانند پنی‌سیلین و استرپتومایسین که از نظر داروسازی مهم هستند، استفاده می‌شود. آنچه که متداول است، کاشت گیاهان دارویی و سپس استخراج ترکیبات فعال از آنهاست. این روش تولید با مشکلاتی روبه رو است که لازم است راههای دیگری بوجود آید. بدون شک بیوسنتز ترکیبات در روش آزمایشگاه (invitro) دارای مزایای زیادی است با این وجود هنوز مشکلات زیادی در این ارتباط وجود دارد.

چشم انداز

کاشت بافتهای گیاهی در آزمایشگاه ، ابزار مناسبی برای رسیدن به هدفهای ناممکن است که در شرایط خارج آزمایشگاه وجود دارد. نتایج کشت در آزمایشگاه دارای اهمیت زیادی در کشاورزی ، باغبانی و جنگلداری است. علاوه بر کاربرد عملی این تکنیک ، کشت سلول گیاهی ، بافت و اندام ، نقش زیادی را در بهبود آگاهی ما در رابطه با علم سلولی _ تکوینی گیاهی داشته است. در حال حاضر کشت سلول ، دارای اهمیتی خاص در بیوتکنولوژی است و متخصصین در حال تلاش جهت رشد سلول گیاهی به منظور بدست آوردن فرآورده‌های صنعتی از متابولیتهای ثانویه هستند.

 

["Pejman"]

اساس کار کشت مریستم بر پایه کشف خاصیت Totypotency سلول، یعنی توانایی بازرویی یک موجود کامل از یک سلول است که در سال 1838 توسط شوان و شیلدن بنا شده است. کشت مریستم از اوایل قرن بیستم آغاز شد. White (1934) اولین کسی بود که روی پراکندگی ویروس TMV در قسمتهای مختلف ریشه توتون کار کرد و حدس زد که مریستم گیاهان می تواند عاری از ویروس باشد (103). Morel (1948) اولین کسی بود که کشت عاری از ویروس مریستم انتهای جوانه را انجام داد و توانست گیاهچه های عاری از ویروس از گیاهان مبتلا به ویروس به دست آورد و فرضیه مصونیت مریستم نسبت به ویروس ها را مطرح کرد. تحقیقات Cornuet & Limasset در 1949 نشان داد که پراکندگی متفاوتی در گیاهانی که به طور سیستمیک آلوده می شوند وجود دارد. آنها با استفاده از روش های بیولوژیک و سرولوژیکی اثبات کردند که غلظت ویروس ها در جوانه ها 150 بار کمتر از برگ های در حال رشد است و این را مطرح کردند که نوک مریستم عاری از ویروس است. در همان زمان Holmes توانست گیاه کوکب را که عاری از ویروس TSWV بود با روش پیوند نوک مریستم روی ساقه زیرزمینی سالم تولید کند. بعد از آن Morel و Martin گیاهان سالمی را از بعضی رقم های گل کوکب و سیب زمینی آلوده به ویروس تولید کردند که با روش برش دادن مریستم و کشت آن در یک محیط کشت مصنوعی انجام شد.

نتایج حاصل از تحقیقات این افراد امکان جدیدی را برای کنترل بیماری های ویروسی فراهم آورد. پس از آن روشهای مختلف درمان گیاه (Therepy) و حذف ویروس مثل گرما درمانی و شیمی درمانی با استفاده از کشت بافت مورد مطالعه و استفاده قرار گرفت.​

 

["Pejman"]

سيستم آب كشت روميزي كه مجهز به هواساز است و داراي بهترين شرايط براي تطبيق پذيري در انتقال گياهان از محيط كنترل شده آزمايشگاه به گلدان است، براي نخستين بار در ايران و در موسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندر قند كرج، طراحي و ساخته شد.
به منظور آگاهي از جزئيات اين سيستم و طريقه كار آن خبرنگار ايانا گفت و گويي با مهندس نسرين ياوري مجري پروژه و عضو هيات علمي موسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندرقند انجام داده است كه مي خوانيم.
سيستم آب كشت چيست و به چه منظوري ابداع شد؟
براي اجراي برنامه كشت بافت گياهي، توليد گياهان در ظروف شيشه اي و پلاستيكي در ابعاد گوناگون انجام مي شود. رطوبت نسبي هوا در ظروف معمولا به 100 درصد مي رسد شرايط نوري و تبادل گازي محدود و تامين مواد معدني و آلي مورد نياز رشد بافت از طريق محيط غذايي، ريز گياهچه هاي توليد شده را قادر به انجام فتوسنتز نمي كند.
حساس ترين مرحله ريز ازدياد كلوني گياهان به روش كشت درون شيشه اي شامل خروج ريز گياهچه ها از محيط ظروف كشت و تطبيق با شرايط رشد فعال در محيط خارج از شيشه است، كه معمولا به دليل يكسان نبودن شرايط درون شيشه و محيط گلدان و حساس بودن گياهچه ها، تعداد زيادي از گياهچه ها از بين مي رفتند، اما سيستم آب كشت براي تطبيق پذيري در انتقال گياهان به محيط گلدان، بهترين شرايط را فراهم مي كند تا ريز گياهچه ها به واسطه تامين آب براي توليد
ريشه هاي جديد، نور، رطوبت نسبي كافي و يكنواخت، توانايي رشد «فتواتوتروفيك» را بدون هيچگونه ضايعات بازيابد بطوريكه گياهاني كه بدين روش به گلدان منتقل مي شوند كمتر از 5 درصد ضايعات دارند.
روش كار اين دستگاه چگونه است؟
گياهچه هاي كامل (ريشه دار) به كمك پنس از داخل ظروف كشت خارج مي شوند و براي حذف آگار باقيمانده، ريشه ها را با آب به آرامي شستشو مي دهند و بلافاصله در دستگاه مستقر مي كنند.
اجزاي تشكيل دهنده دستگاه جويبار عبارتست از محفظه اي شيشه اي كه از صفحه اي مشبك كه محل استقرار گياهچه است، پمپ هواساز و لامپ مهتابي كه هوا و نور مورد نياز گياه را تامين مي كند، تشكيل شده است.
براي تطبيق پذيري در اين دستگاه، ريز گياهچه ها به مدت يك هفته با آب معمولي و در هفته دوم با محلول غذايي هوگلند كه غلظتي معادل 4/1 دارد تغذيه مي شوند و وقتي كه حجم ريشه ها زياد شد زماني است كه گياه آمادگي انتقال به گلدان را پيدا كرده است. همچنين دستگاه قابليت تنظيم هوا، نور و رطوبت را در مراحل مختلف رشد گياه داراست.
ايده ساخت چنين دستگاهي چگونه فراهم شد؟
ساليان پيش، گياه چغندرقند را گياهي حساس به آب مي دانستند، چون چغندر ريشه اي قندي داشته و آب زياد باعث مي شود كه عوامل بيماريزا و آفات به سمت ريشه پر از قند جلب شوند، محققان سالها با آزمايشهاي مختلف سعي كردند كه اين گياه را با شرايط كم آبي تطبيق دهند البته اين نظريه درست است، اما در آزمايشگاه كشت بافت موسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندرقند كرج به يك صورت ديگر به اين مسئله توجه شد.
از آنجايي كه در كشت بافت گياهان، ريشه هاي توليد شده افشان است و در مراحل بعدي اين ريشه ها تبديل به ريشه هاي ذخيره اي مي شوند، بنابراين گياه در اين مرحله حساس به آب نيست، بلكه هر چقدر آب برايش بيشتر فراهم باشد، ريشه هاي افشان بيشتري توليد مي كند.
آزمايشات مختلفي در لوله هاي آزمايشگاهي پر از آب انجام شد تا اينكه در سال 1378 زمينه ساخت اين دستگاه براي اولين بار در ايران، در چارچوب اجراي پروژه ملي شماره 1242 برنامه ملي تحقيقات مصوب شوراي پژوهشهاي علمي كشور با همكاري دانشگاه علوم تهران و محققان آزمايشگاه كشت بافت موسسه فراهم شد و نتايج اين پروژه در قالب گزارش نهايي در سال 1380 منتشر شد و گزارش كوتاهي نيز در شماره 17 مجله چغندرقند نوشته شد.
همچنين در خبرنامه الكترونيكي سازمان كشاورزي و خواربار جهاني گزارشي از اين پروژه در سال 1380 منتشر شد كه مورد توجه علاقمندان ايراني و خارجي قرار گرفت.
استفاده از چنين دستگاهي در ساير كشورها سابقه داشته است؟
خير، اين دستگاه براي اولين بار توسط محققان ايراني ساخته شد و با اطلاع برخي محققان خارجي، پيشنهاداتي براي استفاده از اين ايده شده است، اما اين دستگاه بايد به كشورهايي داراي شرايط آب و هوايي خشكي شبيه ايران هستند و يا مشكل ضايع شدن گياهچه ها در مرحله انتقال به گلدان را دارند، معرفي شود.
در ايران چه مراكزي از اين سيستم استفاده مي كنند؟
فن آوري كشت بافت در ايران، توسعه زيادي پيدا نكرده است و تنها در اين موسسه از اين سيستم استفاده مي شود.
دليل عدم گسترش اين سيستم چه بوده است؟
با توسعه فن آوري كشت بافت، آزمايشگاهها و توليدكنندگان حتما نياز به چنين دستگاهي را احساس خواهند كرد.
همچنين علت ديگر عدم استفاده از سيستم جويبار عدم آگاهي از وجود اين دستگاه است كه سعي شده با معرفي آن در مجلات مختلف و كنگره هاي داخلي و خارجي گامي به سوي آگاهي علاقمندان؛ توليدكنندگان و... برداشته شود.
شرايط تطبيق پذيري غير از چغندرقند براي چه گياهان ديگري وجود دارد؟
پيش بيني شده است كه براي كليه گياهان، امكان استفاده از اين سيستم وجود دارد و تاكنون علاوه بر چغندرقند، گياه استويا نيز بدين روش بدون هيچ گونه ضايعاتي در گلدان كشت شده است چون استويا، گياهي دارويي است كه قند خاصي براي بيماران ديابتي توليد مي كند و به دليل حساس بودن و ريشه دهي ضعيفي كه دارد بدين روش مشكل انتقال به گلدان آن رفع شده است.
چه مراقبتهايي بعد از خروج گياهچه ها از دستگاه آب كشت بايد اعمال شود؟
گياهچه هاي جوان پس از طي دوره اي پانزده روزه در زماني كه حجم ريشه قابل قبولي براي انتقال به گلدان پيدا كردند. بايد در خاكي استريليزه شده حاوي مخلوطي از خاك باغچه، ماسه و پيت ماس قرار گيرند.
محيط نگهداري گلدانها نيز بايد در گلخانه اي صورت گيرد كه از لحاظ شرايط دما، رطوبت، عوامل بيماريزا، نور، آفات و... كنترل شده باشد.
البته در هفته نخست انتقال به گلخانه، مراقبتهاي بيشتر براي تامين شرايط فوق ضروري است و با شروع فصل بهار تعويض گلدانها و تغذيه كودي گياهان و كنترل عوامل بيماريزا توصيه مي شود.

 

["Pejman"]

کشت بافت tissue culture گیاهی یک عبارت کلی برای کشت پروتوپلاست ، سلول ، بافت و اندام گیاهی در شرایط استریل in vitro است به عبارت دیگر کشت بافت گیاهی تکنیکی است که تولید و تکثیر گیاه کامل را از بافتهای مختلف گیاه امکان پذیر می سازد مهمترین اهمیت این تکنیک نشان دادن توانایی سلولهای گیاهی یعنی توتی پوتنسی سلول بدین معنی که تمام سلولهای زنده پیکر گیاه ، صرف نظر از سطح پلوئیدی و نوع تخصص ، توانایی تشکیل گیاه کامل را دارند ، می باشد .
کشت بافت را می توان از تحقیقات گاتریت 1985 بر روی مواد التبام دهنده زخم های گیاهی و تشکیل کالوس و مطالعات میکروسکوپی توسط اشلیدن 1838 و شوان 1839 که تئوری سلولی را ارئه دادند نسبت دارد در آغاز استفاده از زیر نمونه های حاوی سلول های مریستم نوک ریشه ی گوجه فرنگی و سپس کشت جنین جو و سایر ریز نمونه ها رونق یافت در دوره پیشرفت کشت بافت ، تکنیک های جدید ابداع گردید از جمله آنها می توان استفاده از آب نارگیل ، استفاده از اکسین ، استفاده از سیتوکینین کشت تک سلول و کشت پرستار را نام برد در دوره اخیر به طور قرار دادی کار برروی کشت بافت به 5 گروه تقسیم می شود : الف ) رفتار سلولی ب ) تغییر و اصلاح گیاهان ج ) گیاهان عاری از عوامل بیماری زاد و ذخیره ژرم پلاسم د ) تکثیر کلونی هـ ) تولید فرآورده

 

["Pejman"]

این هم چند تا منبع خوب :

- احسانپور ، علی اکبر : کشت سلول و بافت گیاهی ،علی اکبر احسانپور ، فریبا امین ، اصفهان ، جهاد دانشگاهی 1380
- اونز ، دیوید : کشت بافت گیاهی ، نویسندگان ایوانز ، کولمن ، کارنز مترجمین آرش فروتن ، ریحانه وادی دار ، تهران سپهر 1385
- بوتینو : روشهای کشت بافت گیاهی ، ترجمه محمد حسن راشد ، محمد بنائیان ، مشهد ، جاوید 1385
- پیری ، خسرو ، راهنمای کشت بافت گیاهی ، محمد رضا حسن دخت ، راحله ابریشمی ، تهران : مرز دانش 1385
- مشایخی ، کامبیز ، موارد معدنی و آلی مورد استفاده در کشت بافت گیاهی ، کامبیز مشایخی ، وحید اکبر پور : گرگان مختوم قلی فراقی 1387. -

 

["Pejman"]

کشت جنين

کشت جنين يکي از روشهاي بيوتکنولوژي است که در مدتها پيش در اصلاح نباتات براي توليد گياهان هيبريد بين گونه اي يا بين جنسي بکار برده شده است. در اين روش، جنين چند روزه از بذري که در حال رشد است جدا مي شود و روي يک ماده غذايي جامد يا محلول تحت شرايط محيطي کنترل شده ، مورد کشت قرار مي گيرد تا توليد يک گياهک کند. اين گياهک را سپس در خاک مي کارند تا به رشد کامل برسد.
کشت جنين براي نگهداري جنين هاي توليد شده از تلاقي بين گونه ها و بين جنسهاي مختلف که از نظر خويشاوندي از يکديگر دور هستند ضروري است زيرا در اغلب اين نوع تلاقي ها جنين سقط مي شود. وجود ژنومهاي مختلف و ناسازگار در ژنوتيپ اينگونه جنين ها سبب اختلالاتي در دوره رشد جنين شده و بدين ترتيب جنين از بين مي رود. يکي از عوامل مهم در سقط جنين ، عدم توليد و يا از بين رفتن مواد غذائي جنين ، يعني بافت اندوسپرم است. اگر جنين هيبريد قبل از سقط از بذر جدا شود و روي ماده غذائي مناسبي قرار داده شود ، رشد جنين ممکن است ادامه يابد و به گياه کاملي بيانجامد.
کشت جنين معمولا شامل نگهداري آن به مدت دو تا چهار هفته در دستگاههاي رشد در تاريکي و در حرارت 20 درجه سانتيگراد يا کمي کمتر مي باشد. سپس جنين را به مدت کوتاهي در معرض نور و در حرارت بالاي 20 درجه سانتيگراد قرار مي دهند. مرحله بعدي، انتقال جنين به روي يک ماده غذائي نسبتا جامد است که سبب تسريع در رشد ريشه و ساقه مي شود. بعد از رشد کافي ريشه و ساقه ، جنين را در گلخانه اي با رطوبت زياد و حرارت مناسب در گلدان مي کارند و چنانچه لازم باشد بعدا به مزرعه منتقل خواهند کرد. ماده غذائي مورد استفاده در کشت جنيني معمولا از املاح معدني ، قند ، ويتامين ها ، اسيدهاي آمينه ، هورمونها و ساير مواد غذائي ديگر مانند شير نارگيل تشکيل شده است.

کاربرد کشت جنين
از کشت جنين براي توليد هيبريد در چندين گونه استفاده شده است. مثلا از کشت جنين براي توليد گياه هيبريد از تلاقي شبدر ديپلوئيد و تتراپلوئيد استفاده شده است. جنين هاي هيبريد حاصله از تلاقي بين گونه اي گندم با موفقيت کشت شده اند. همچنين از کشت جنين براي تسريع در به نژادي انگور بي دانه و درختان ميوه مانند هلو ، شليل و آلو استفاده شده است. از طريق کشت جنين توانسته اند هيبريد بين گونه اي در جنس پنبه و در جنس لوبيا و هيبريد بين جنسي بين دو جنس گندم و جو توليد کنند.
مورد استفاده ديگر کشت جنين ، مطالعه و از بين بردن دوره خواب بذر يا هسته است. جدا کردن جنين از بذر يا هسته ، سبب از بين رفتن دوره خواب بذر که در اثر وجود پوسته غير قابل نفوذ است مي شود. همچنين مي توان با اضافه کردن هورمونها يا آنزيمها و يا ساير مواد شيميائي ، عوامل فيزيولوژيکي را که سبب بوجود آمدن دوره خواب مي شوند از بين برد.

 

["Pejman"]

فن کشت بافت گیاهی
آزمايشگاه كشت بافت
عنوان يافته تحقيقاتي: ريزازدياد كلوني ژنوتيپهاي منتخب به روش كشت درون شيشه
مقدمه: چغندرقند يك گياه دو ساله و دگرگشن است. تكثير غير جنسي اين گياه به روش ريزازدياد كلوني در شرايط درون شيشه موجب دستيابي به يكنواختي بيشتر در اجراي آزمايشهاي تركيب پذيري و نيز حفظ منابع ژنتيكي مورد نياز برنامه هاي بهنژادي اين گياه مي گردد. توليد جوانه هاي نا به جا از بافتهاي گوناگون امكان پذير است. با توجه به اين كه صفات زراعي بوته هاي انتخاب شده در سال اول مورد بررسي قرار مي گيرد استفاده از بافت ساقه گلدهنده پس از اجراي اين بررسيها بهترين نتايج را حاصل مي آورد. بافت ساقه گلدهنده بوته هاي مورد نظر پس از نمونه برداري در آزمايشگاه استريل مي گردد و در محيط هاي غذايي منتخب حاوي هورمونهاي رشد در چرخه ازدياد قرار مي گيرد.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: آزمايشهاي به اجرا در آمده موجب كسب نتايج معتبر و قابل تكرار در زمينه مراحل مختلف كشت در شرايط آزمايشگاهي گرديده است. ساقه گلدهنده گياه ورناليزه شده چغندرقند پس از شستشو و استريليزاسيون با محلول الكل 70% و سپس با هيپوكلريت سديم 2-1% و آبكشي با آب استريل در محيطهاي 1- القا جوانه هاي رويشي 2- ازدياد جوانه ها 3- ريشه زايي حاوي تركيب نمكهاي اصلي و فرعي, هورمونهاي رشد، قند و ماده آگار كشت مي گردند. ميزان ازدياد جوانه ها در ژنوتيپها متغير است اما در هر چرخه 4 هفته, اين ميزان بين 5 و 7 برابر مي باشد. نگهداري جوانه ها در محيط سردخانه و نور ملايم امكان پذير مي باشد.
روش ازدياد و نگهداري جوانه هاي رويشي حاصل از ريزازدياد كلوني ژنوتيپهاي برتر در شرايط درون شيشه در حال حاضر بخشي از عمليات مورد نياز در برنامه هاي بهنژادي بسياري از گياهان از جمله چغندرقند مي باشد.
اهميت اقتصادي: يكنواختي، تكرارپذيري عمليات دورگ گيري و نگهداري منابع ژني مورد استفاده در برنامه هاي به نژادي موجب تسهيل و تسريع در امر دستيابي به نتايج تلاقي هاي گونه هاي زراعي و نيز گونه هاي وحشي و معرفي ارقام جديد چغندرقند مي گردد.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 112KB.

ريزازدياد كلوني​

عنوان يافته تحقيقاتي: توليد گياهان هاپلوئيد و دابل هاپلوئيد با استفاده از روش كشت تخمك بارور نشده و تيمار كلشي سين در شرايط كشت درون شيشه
مقدمه : كشت گامت در گياهان با هدف شناسايي و تثبيت برخي از صفات زراعي و نيز ايجاد گياه هاپلوئيد به اجرا در مي آيد. در اغلب گياهان كشت دانه گرده با موفقيت روبرو شده است، در حالي كه در چغندر قند كشت اين سلول به نتيجه نرسيده و تخمك بارور نشده منشا توليد گياهان هاپلوئيد قرار گرفته است. آزمايشهاي گوناگون در رابطه با نمونه قابل كشت، محيط كشت مناسب و تركيب هورمون ها به اجرا در آمده است. در پژوهشهاي به اجرا در آمده در ايران لاينهاي هاپلوئيد حاصل از كشت تخمك بدست آمده است. اجراي تيمار كلشي سين براي دو برابر كردن تعداد كروموزمهاي گياهان هاپلوئيد در آزمايشهاي مختلف مورد بررسي قرار گرفته و نهايتا در شرايط كشت بافت هاپلوئيد درون شيشه هاي كشت به كار گرفته شده است.
شرح يافته و توصيه هاي كاربردي: اجراي كشت تخمك بارور نشده با نمونه برداري از بوته هاي ورناليزه آغاز مي گردد. ساقه هايي كه گلي در قاعده آنها شكفته باشد جهت برداشت انتخاب مي شوند. از اين ساقه ها پس از استريليزاسيون در محيط استريل با استفاده از لوپ بينوكولر تخمك هاي بارور نشده از دورن غنچه گل خارج و در محيط غذايي انتخاب شده N6 حاوي هورمونهاي NAA و BA و ميزان قند 6% كشت گرديد. ميزان جوابگويي ژنوتيپها بين 1 تا 5/10% ثبت شده است. بافت و گياهچه هاي هاپلوئيد در محيط ازدياد تكثير و در شرايط دورن شيشه با محلول كلشي سين در غلظت 05/0% به مدت 48 ساعت تحت تيمار قرار مي گرفت. جوانه هاي حاصل از بافت و گياهچه هاي در حال تكثير در محيط عاري از اين ماده سطح پلوئيدي مضاعف نشان داده است . اين گياهان به نام گياهان دابل هاپلوئيد (DH) چغندرقند داراي ژنوم تثبيت شده مي باشند.
اهميت اقتصادي: لاينهاي دابل هاپلوئيد به عنوان والد هيبريد براي افزايش ميزان هتروزيس در برخي صفات زراعي و نيز به عنوان منابع ژني با صفات تثبيت شده مقاومت به بيماريها و آفات به كار مي روند. كاهش دوره سلكسيون براي تثبيت ژنها از مهمترين امتيازات اجراي روش هاپلوديپلوئيديزاسيون در گياهان مي باشد و به ويژه در گياهان دگر گشن حائز اهميت است.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 86KB.

​

عنوان يافته تحقيقاتي: توليد جنين سماتيكي چغندرقند از طريق اجراي تيمار TIBA/Proline در شرايط جوانه
زني بذر و اجراي كشت درون شيشه
مقدمه : توليد جنين غير جنسي يا رويشي در شرايط كشت درون شيشه يكي از روشهاي جديد ازدياد رويشي گياهان تلقي مي گردد. در اين روش سلولهاي رويشي بافت گياه در شرايط كشت مصنوعي ايجاد بافت جنين زا مي نمايد و جنين هاي رويشي حاصل كه مشابه جنين هاي زايشي به مرحله رسيدگي مي رسند يكنواختي ژنتيكي بيشتري دارند. دستيابي به جنين هاي رويشي در برنامه هاي به نژادي و توليد بذرتجاري به منظور انتقال ژن، ايجاد مقاومت به تنش هاي گوناگون، بررسيهاي مولكولي و توليد بذر مصنوعي مورد توجه قرار دارند.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: در اين تحقيق بافت كوتيلدوني و هيپوكوتيل جوانه بذري لاين ديپلوئيد منوژرم 9597 و متعاقباً قطعات كوچك بافت كال براي ايجاد كشت سوسپانسيون سلولي به كار رفته است. استفاده از آنتي اكسين TIBA و اسيدآمينه پرولين، موجب دستيابي به يك روند القا ، باززايي و رشد جنين هاي رويشي يا سوماتيكي گرديده است. استفاده از آنتي اكسين در القا جنين زايي در چغندرقند و پرولين در روند تكاملي بافت جنين زا توصيه مي گردد.
اهميت اقتصادي: ازدياد رويشي يكنواخت يك گياه براي برنامه بهنژادي اين گياه نيروي پتانسيل عظيمي ايجاد مي نمايد كه اگر مورد بهره برداري صحيح و علمي قرار گيرد زمينه هاي مختلف كاربردي دارد. از جمله انتقال ژن و دستيابي به گياهان ناقل ژن مطلوب زراعي در چغندرقند.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 92KB.

جنين هاي رويشي چغندرقند​

عنوان يافته هاي تحقيقاتي: تلاقي بين گونه أي چغندرقند Beta vulgaris با گونه هاي وحشي گروه Procumbentes و كنترل ماهيت هيبريد توسط ماركرهاي مولكولي RAPD
مقدمه : گونه هاي وحشي چغندرقند از جمله گونه هاي گروه Procumbentes به علت دارا بودن ژنهاي مقاومت به آفات و بيماريها مورد توجه به نژادگردان قرار گرفته است. در اين تحقيق تلاقي بين چغندرقند L. Beta vulgaris توده تتراپلوئيد 37RT (والد مادري) و سه گونه وحشي (والد گرده افشان) به شرح زير انجام گرفت.
37RT(4n) × B. webbiana(2n) , 37RT(4n) × B. procumbens(2n) , 37RT(4n) × B. patellaris (4n)
براي اجراي تلاقي، بساكها از گلهاي والد مادري حذف شد و بعد از 2 الي 4 روز با گرده جمع آوري شده تلقيح به طور دستي انجام شد. مطالعه مراحل نمو جنين با واكنش تخمك هاي باور شده به محلول 1% تترازوليوم كلرايد كنترل شد. جنين هاي كامل در محيط كشت N6 حاوي هورمونهاي NAA , BA, GA3 كشت گرديد.كنترل ماهيت هيبريدها با استخراجDNA برگ گياهان بدست آمده در شرايط درون شيشه و استفاده از روش PCR با پرايمرهاي تصادفي OPX2, OPX15 به اثبات رسيده است.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: نتايج حاصل از بررسيها نشان داد كه ايجاد هيبريدهاي بين گونه أي از طريق نجات جنين در شرايط كشت درون شيشه امكان پذير است. جنين هاي مورد مطالعه در روز بيستم پس از تلقيح كاملا رشد يافته بودند و اين زمان جهت كشت تعيين گرديد. در مراحل اوليه ريشه زايي توسط اين جنين ها در چند مورد مشاهده شد اما اين ريشه ها نكروزه گرديدند. ماهيت هيبريد گياهان بدست آمده در ظروف كشت با استفاده از تكنيك PCR و پرايمرهاي OPX2 , OPX15 كنترل گرديد. وجود باندهاي مشترك گياهان والد در مكان مشخص در هيبريد ها به اثبات رسيد. ايجاد تنوع ژنتيكي از طريق اجراي تلاقي بين گونه أي و كنترل هيبريدها در سطح مولكولي در برنامه بهنژادي چغندرقند قابل توصيه مي باشد.
اهميت اقتصادي: استفاده از گياهان دورگ كه داراي ژنهاي مقاومت به بيماريها و آفات مي باشند در برنامه بهنژادي چغندرقند اهيمت به سزايي در افزايش سطح زير كشت، عملكرد محصول و كاهش مصرف سموم دفع آفات خواهد داشت.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1482x1056 و پهنای 66KB.

جنين هيبريد بين گونه اي كامل

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 908x807 و پهنای 85KB.

باندهاي حاصل از PCR پرايمر تصادفي​

عنوان يافته تحقيقاتي: بررسي ميزان مقاومت به تنش شوري در لاينهاي سلولي و بافت جوانه زاي چغندرقند در شرايط درون شيشه
مقدمه : از سال 1367 در ايران آزمايشهاي متعددي در ارتباط با ارزيابي مقاومت به شوري در گياه چغندرقند در شرايط آزمايشگاهي در مرحله جوانه زني و رشد گياه كامل در محيط گلخانه و مزرعه صورت گرفته است. ميزان مقاومت به شوري در سطح رشد سلولي در شرايط درون شيشه با شرايط تنش در گياه كامل تطبيق دارد. باتوجه به نتايج مفيد تحقيقات به اجرا درآمده (1371 و 1375) ارزيابي اين مقاومت در لاينهاي سلولي و بافت كوتيلدوني جوانه زاي چغندرقند در شرايط درون شيشه بررسي شد. منابع گياهي حاصل از آزمايشها در مراحل بعدي از نظر تفاوتهاي موجود در سطح ماركرهاي مولكولي كنترل مي گردند.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: در آزمايشهاي به اجرا در آمده بافت هاپلوئيد باززا حاصل از كشت تخمك بارور نشده و بافت كوتيلدوني جوانه بذري در سطوح 100، 150 و 250 ميلي مول نمك كلرورسديم كشت گرديدند و جوانه هاي باززايي شده در كليه موارد در شرايط رشد ازديادي قرار داده شدند. اين جوانه ها به عنوان منابع گياهي مقاومت به شوري نگهداري خواهد شد. در حال حاضر از لاينهاي 261, H261.06 لاين نر عقيم و گرده افشان، 9597 و7233 جوانه هاي سلكسيون شده در سطوح بالاي نمك موجود مي باشد. به كارگيري محيط تنش شوري در آزمايشهاي به نژادي گياهان جهت ارزيابي هاي گوناگون در سطح بافت و يا مولكولي توصيه مي گردد.
اهميت اقتصادي: استفاده از شرايط كشت درون شيشه درآزمايشگاه با كنترل عوامل محيطيشرايط آزمايشي يكنواخت و قابل اطميناني را فراهم مي سازد كه در جوار آزمايشهاي مزرعه مي تواند موجب فراهم شدن تسهيلات و تسريع در پيشبرد اهداف به نژادي گردد.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 98KB.

شناسايي تحمل به شوري در لاين سلولي هاپلوئيد باززا​

عنوان يافته تحقيقاتي: جداسازي و كشت پروتوپلاست چغندرقند و توليد بافت باززا در شرايط درون شيشه

​

 

["Pejman"]

مقدمه : بهره برداري از توان باززايي گياه كامل توسط يك سلول گياهي مي تواند موجب وسعت عمل در انتخاب و انتقال مزرعه آزمايشي به روي ميز كار آزمايشگاه گردد. به نژادگر مي تواند با استفاده از يك گرم بافت گياهي تعداد 105×23 پروتوپلاست گياهي را در يك ميلي ليتر محلول شناور سازد و مطالعات گوناگوني را به اجرا بگذارد. بررسي جداسازي و كشت پروتوپلاست لاينهاي چغندرقند شامل انتخاب محلول آنزيمي، بافت مناسب كه بتواند منشا پروتوپلاست باشد و نيز روش خالص سازي و كشت پروتوپلاست بوده است. بافت مزوفيل برگ داراي كلروپلاست و نيز بافت سوسپانسيون سلولي فاقد كلروپلاست و داراي قدرت باززايي زياد در اين بررسيها به كار گرفته شد.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: مناسبترين تركيب، غلظت و مدت تيمار آنزيمي جهت جداسازي پروتوپلاست به شرح زير تعيين گرديد.
بافت مزوفيل برگ : سلولاز RS (g/l 5) + دري سلاز (g/l 1) + پكتيناز (g/l 5)
بافت سوسپانسيون سلولي : سلولاز RS (g/l10) + دري سلاز (g/l2) + پكتيناز (g/l10)
خالص سازي در شرايط ايده آل : دستيابي تراكم105× 23 پروتوپلاست در ميلي ليتر منجر گرديد.
كشت پروتوپلاست و تشكيل ميكروكالها در محيط غذايي K8P و سپس N6 و محيط جنين زايي باعث ايجاد كالوس جنين زا گرديد. استفاده از بافت سوسپانسيون سلولي با منشا كالوس جنين زا و تازه موجب افزايش باززايي پروتوپلاست هاي ايجاد شده گرديد. بنابراين به نظر مي رسد كه به هنگام بهره گيري عملي از اين تكنيك بافت فوق بر بافت مزوفيل ارجحيت دارد.
اهميت اقتصادي: با تكميل تحقيقات مربوط به كشت پروتوپلاست، از تكنيك فوق مي توان در موارد زير بهره مند گرديد :
1-مهندسي ژنتيك چغندرقند ، 2 - انتقال ژن از طريق امتزاج پروتوپلاست ، 3- مطالعات پايه علوم سلولي
دستيابي به اين فن آوري در زمينه آموزش متخصصين و پيشبرد تحقيقات در داخل كشور از اهميت بسيار برخوردار است.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 97KB.

​

عنوان يافته تحقيقاتي: غربال نمودن لاينهاي چغندرقند از نظر مقاومت به تنش شوري در مرحله جوانه زني بذر در شرايط درون شيشه
مقدمه : ارزيابي ميزان مقاومت ارقام و يا لاينهاي چغندرقند در شرايط آزمايشگاهي با استفاده از محيط كشت غذايي حاوي نمك كلرورسديم در مرحله جوانه زني بذور كه مرحله حساس زراعت در ارتباط با مقاومت به شوري مي باشد براي تعدادي از لاينهاي مقاوم و حساس به اجرا در آمده است. مطالعات فيزيولوژيك و مرفولوژيك براي اين ارزيابي به كار گرفته شد. وضعيت ظاهري گياهچه ها و بروز علائم تنش در اندامهاي گياهچه مورد توجه قرار گرفت. سطوح آزمايشي نمك براي ايجاد شرايط جوانه زني در محيط كشت با ارزش هدايت الكتريكي (EC) 16 و 24 تنظيم گرديد.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: در محيط غذايي با هدايت الكتريكي 16 و 24 تعداد 20 لاين از منابع منوژرم و مولتي ژرم مورد ارزيابي قرار گرفته و پس از يك هفته يادداشت برداري جوانه زدن شروع شد بعد از چهار هفته (28 روز)بذرهاي جوانه زده يادداشت برداري و ثبت گرديد. با استفاده از طرح آماري كاملا تصادفي با دو تكرار نسبت به محاسبات آماري اقدام و درصد جوانه زده ها در هر هدايت الكتريكي جداگانه برآوردشد. مشخص گرديد در (EC) 24 ميلي موس بر سانتيمتر لاين هاي شماره 3 و 4 از اوريژين 7233 و لاين هاي 38 و 138 از اوريژين 8001 در مقايسه يا ساير اوريژن ها در اين محيط درصد جوانه بيشتري داشتند اين منابع جمع آوري و در جهت تكثير و نگهداري آن اقدام شد.
اهميت اقتصادي: با به كارگيري روش هاي آزمايشگاهي و بخصوص محيط كنترل شده كه حاوي غلظت هاي متفاوت نمك است در مقايسه با روش هاي مزرعه و گلخانه حداقل 50% در هزينه صرفه جويي مي شود. اين لاين هاي انتخاب شده از نظر ارزش تحقيقاتي هر كدام بيش از چند هزار دلار براي موسسه اهميت دارد. اگر موسسه بخواهد چنين منابعي را از خارج وارد نمايد در چهارچوب يك قرارداد علمي و تحقيقاتي و با پيش بيني پرداخت حق قرارداد زياد (حداقل 20000 دلار) انجام گيرد. از اين منابع در ايجاد واريته هاي مقاوم به شوري استفاده خواهد شد.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 110KB.

غربال كردن لاين ها​

عنوان يافته هاي تحقيقاتي: ارزيابي جوابگويي به روش ريزازدياد كلوني در توده هاي تتراپلوئيد چغندرقند
مقدمه : روش ريزازدياد كلوني به عنوان روش ازدياد غير جنسي گياهان به ويژه گياهان دگرگشن به دليل نياز به ازدياد پايه هاي منتخب براي اجراي تلاقيهاي مورد نظر در به نژادي از اهميت زيادي برخوردار است. باتوجه به اين كه توده هاي تتراپلوئيد به عنوان والد گرده افشان بذر تريپلوئيد چغندرقند در تلاقي هاي گوناگون وارد مي گردد، ارزيابي جوابگويي اين توده ها به روش ريزازدياد كلوني در امر نگهداري كلون هاي نمونه يا سلكسيون شده مورد نياز مي باشد.
شرح يافته وتوصيه هاي كاربردي: در آزمايش مقايسه جوابگويي مراحل القا جوانه رويشي و سپس ازدياد جوانه هاي رويشي در چرخه ازدياد از بوته هاي توده هاي Lit13, C3-3, 37RT, 19669 نمونه گيري انجام گرفت. نمونه هاي استريل در محيط غذايي PGOB حاوي هورمونهاي IBA, GA3, BA در مرحله القا جوانه رويشي و در همان محيط حاوي هورمونهاي IBA, BA NAA, مرحله ازدياد قرار گرفتند. در ميان تودها، نمونه هاي توده C3-3 به واسطه بالاترين تعداد جوانه رويشي القا شده. با سه توده ديگر تفاوت معني دار نشان داد، اما ميزان نهايي ازياد جوانه در مرحله دوم با تعداد جوانه القا شده متناسب نبودتوليد جوانه نمونه هاي توده 37RT در هر دو مرحله يكنواختي بيشتري نشان داده ميزان ازدياد جوانه در مرحله دوم به عوامل ديگري چون اندازه، قدرت، شكل و تعداد برگها در جوانه القا شده اوليه ارتباط پيدا مي نمايد.
براي پيشبرد امر ريزازديادكلوني در توده هاي گوناگون، تعداد اوليه نمونه بايد مد نظر قرار گرفته شود و در مرحله ازدياد رويشي جوانه ها از نظر عواملي همچون اندازه، قدرت رشد، تعداد برگ، سلامت ظاهري و شكل طبيعي انتخاب گردند.
اهميت اقتصادي: با توجه به اين كه افزايش ميزان توليد جوانه رويشي در مرحله ازدياد موجب استفاده بهتر از امكانات شرايط رشد در محيط مصنوعي مي گردد. نگهداري نمونه هاي پر بازده كه جوابگويي بالاتري به شرايط رشد در محيط مصنوعي دارند مقرون به صرفه تر است.

این تصویر تغییر اندازه یافته است برای دیدن اندازه واقعی اینجا کلیک کنید. اندازه واقعی تصویر حجم 1462x1043 و پهنای 70KB.

​

 

[hortilover]

روشهای کشت بافت به همراه مباحث آزمایشگاهی ... دکتر مهدی شاهسوند

روشهای کشت بافت به همراه مباحث آزمایشگاهی ... دکتر مهدی شاهسوند

تعریف کشت بافت
به کشت قطعه ای از بافت گیاه در شرایط آزمایشگاهی و کاملا استریل، کشت بافت یا کشت درون شیشه ای(invitro) می گویندکه در نهایت از این قطعه ، یک گیاه کامل به دست می آید.اصطلاح invitro در برابر اصطلاح invivo (کشت در فضای آزاد) می باشد.
تاریخچه کشت بافت: سابقه کشت بافت حدودا به یک قرن پیش باز می گرددو اساس کشت بافت به تئوری شیلدن و شوان مربوط می شود. بر اساس این تئوری، هر سلول از موجود زنده اگر در شرایط مطلوب قرار گیرد ، به یک گیاه کامل تکامل می یابد. این خاصیت Toti potency نامیده می شود.بعد از آن دانشمندان بر اساس همین تئوری به موفقیت هایی دست یافتند.

اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی
1)تولید گیاهان عاری از ویروس و بیماری.
2)تکثیر و ریز ازدیادی گیاهان (Micropropagation) .
3)تولید گیاهان هاپلوئید و سپس دیپلوئید کاملا هموزیگوس از طریق کشت میکروسپور یا بساک.
4)دست ورزی ژنتیکی و دورگ گیری سوماتیکی با استفاده از الحاق پروتوپلاسمی و همچنین ایجاد تلاقی بین گونه ای در شرایط درون شیشه ای.
5)کشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت های اولیه مثل قند وکربن و نیز متابولیت های ثانویه.
6)ایجاد گیاهانی با خصوصیات جدید با استفاده از تنوع سوماکلونال.
7)نجات جنین با استفاده از کشت جنین های نارس در تلاقی بین گونه ای.
8)نگهداری ژرم پلاسم گیاهان در شرایط درون شیشه ای.
9)استفاده از کشت بافت در انتقال ژن به گیاهان.
10)استفاده در مطالعات بافت شناسی ، سلول شناسی ، و فیزیولوژی گیاهی .

انواع کشت بافت
· کشت بذر
· کشت جنین
· کشت کالوس
· کشت اندام ( برگ ، ریشه ، ساقه ، مریستم و دانه گرده )
· کشت سوسپانسیون سلولی
· کشت پروتوپلاست

محیط کشت (Medium)
در شرایط آزمایشگاهی به اولین چیزی که نیاز داریم یک بستر مناسب برای رشد گیاه می باشد ، به این بستر اصطلاحا محیط کشت می گویند.در محیط کشت کلیه مواد غذایی زیر وجود دارد:
ü عناصر ماکرو
ü عناصر میکرو
ü هیدرات های کربن یا قند ها
ü ویتامین ها
ü هورمون ها
ü اسید های آمینه همچون گلایسین و ترکیبات پیچیده مثل پپتون
ü هیدرولیزات کازئین
ü شیر نارگیل
ü پلی آمین
ü آگار
ü آب
عناصر ماکرو: این مواد به مقداری بیش از 0.5 میلی مول بر لیتر ، مورد نیاز گیاه می باشند. این عناصر شامل :Ca , MgSN , P , K , می باشند. معولا عناصر معدنی ماکرو به صورت استوک ساخته و در یخچال نگهداری می شوند. در تهیه استوک باید دقت شودکه مواد ترکیب شده ، تشکیل رسوب ندهند. به عنوان مثال در بین عناصر ماکرو، منیزیوم را معمولا به صورت استوک جداگانه تهیه می کنند.
نقش عناصر ماکرو در محیط کشت
نیتروژن: در ساختمان پروتئین ها ، نوکلئوتید ها ، برخی کوانزیم ها وجود دارد.
فسفر: در ساختمان اسید های نوکلئیک ، ATP و مواد حد واسط فتوسنتز وتنفس وجود دارد.
پتاسیم: مهمترین کاتیون تنظیم کننده فشار اسمزی در سلول می باشد.
کلسیم: در بیوسنتز دیواره سلولی موثر است.
منیزیوم: در ساختمان کلروفیل نقش دارد و به عنوان کوفاکتور عمل می کند. [ فعال کننده آنزیم را کوفاکتور گویند که ممکن است ماده ای آلی یا معدنی باشد.]
گوگرد: در ساختمان اسید های آمینه مثل سیستئین و متیونین ( پیش ماده سنتز اتیلن ) نقش دارد و در ساختمان برخی کوانزیم ها دیده می شود.
عناصر میکرو
این مواد به مقداری کمتر از 0.5 میلی مول بر لیتر مورد نیاز گیاه می باشند.این عناصر شاملFe , Mn , Cu , B , Zn , Co , I , Mo می باشند.در میان این عناصر فقط آهن به صورت استوک جداگانه و بقیه عناصر به صورت یک استوک (استوک میکرو) ساخته می شود.
ادامه......

 

[hortilover]

معمولا استوک آهن درون فویل پیچیده می شود زیرا نور تجزیه کننده آهن است. محلول استوک نمک های میکرو همانند استوک نمک های ماکرو برای کوتاه مدت در یخچال قابل نگهداری است. و برای نگهداری طولانی مدت ، از فریزر استفاده می شود.
نقش عناصر میکرو در محیط کشت
مس: به عنوان کوفاکتور عمل می کند و در واکنش های زنجیره انتقال الکترون نقش دارد.
روی: در بیوسنتز کلروفیل و هورمون اکسین موثر است و به عنوان کوفاکتور نیز عمل می کند.
آهن : در زنجیره انتقال الکترون موثر است.
منگنز: به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
مولیبدن: به عنوان کو فاکتور عمل می کند و در ساختمان برخی آنزیم ها دیده شده است.
کبالت : در ساختمان برخی ویتامین ها مثل B12بکار رفته است.
ید: به دلیل سمیت ، کاربرد زیادی در کشت بافت ندارد.
بور: به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
قندها یا هیدرات های کربن
به دلیل نور کم در محیط درون شیشه ای، فتوسنتز چندانی صورت نمی گیرد، لذا افزودن قند در محیط کشت کاملا ضروری است. معمولا از قند ساکاروز ، فروکتوز و گلوکز استفاده می شود. میزان غلظت قند افزوده شده به محیط ، بستگی به نوع ریز نمونه (Explant) و سن آن دارد. مثلا جنین های جوان به درصد بالاتری قند نیاز دارند. نکته مهمی که باید توجه کرد اینست که قند ها در اثر اتوکلاو نمودن، دچار تغییر می شوند.
ویتامین ها
اکثر ویتامین ها توسط گیاه ساخته می شود؛ لیکن اضافه نمودن برخی از ویتامین هانظیر اسید نیکوتینیک(B3) ، تیامین (B1) ، پیرودوکسین (B6) و... به محیط کشت ضروری است. همچنین از ویتامینC به عنوان آنتی اکسیدان استفاده می شود. ویتامین ها معمولا به صورت استوک100X ( یعنی صد برابر) تهیه می شوند عموما ویتامین ها را توسط صافی ، استریل می کنند و از اتوکلاو (به دلیل حساسیت ویتامین ها به گرما) استفاده نمی شود.
هورمون ها
معمولا هورمون ها در ایجاد تمایز و شکل گیری اندام ها موثر هستند، مهمترین هورمون های گیاهی که در کشت بافت استفاده می شوند عبارتند از : اکسین ، سیتوکینین ، جیبرلین. البته گاهی هم از آبسزیک اسید استفاده می گردد. سیتوکینین از مهمترین هورمون ها در تمایز بافت ها می باشد. استفاده از جیبرلین ، محدود به کشت جنین است چون جیبرلین از اندام زایی( ارگانوژنز) جلوگیری می نماید. اکسین کاربرد زیادی در کشت بافت دارد و شامل IAA ( اکسین طبیعی که به دلیل ناپایداری در مقابل نور و دما ، درون فویل نگهداری می شود) ، NAA ، IBA، 2,4,D ( از 2,4,D استفاده چندانی در کشت بافت نمی شود چون این ماده سبب ایجاد موتاسیون می کند ونیز مانع فتوسنتز می باشد ، ولیکن از 2,4,D در القا جنین زایی سوماتیکی بهره می گیرند.

آزمایشگاه کشت بافت
عموما یک آزمایشگاه کشت بافت از چهار قسمت تشکیل شده است :
1) اتاق تهیه محلول ها و محیط کشت و نگهداری مواد و همچنین قسمت شستشوشوی ظروف
2) اتاق مخصوص ریزنمونه ها یا Explants .
3) اتاق نگهداری و رشد گیاه کشت شده در محیط کشت، که اصطلاحا به آن گراس چمبر می گویند. نور ، دما و رطوبت در این محل کاملا کنترل شده میباشد.
گلخانه کوچک سرپوشیده که آخرین مکان نگهداری ریز نمونه ها می باشد

 

[hortilover]

اکسینها ، عموما به منظور افزایش رشد سلول ها و همچنین تولید اندام و یا القای جنین زایی سوماتیکی و یا القای کالوس به کار می رود. در حین تولید اندام نسبت مناسب اکسین به سیتوکینین باید رعایت شود. میزان اکسین با غلظت کمتر ( نسبت به سیتو کینین) تولید ساقه، نسبت بیشتر اکسین ( نسبت به سیتوکینین) تولید ریشه می کند.اگر غلظت اکسین خیلی زیاد باشد، تولید اندام نمی کند بلکه کالوس تولید می شود.​

◙ نکته مهم: به منظور تهیه استوک اکسین ، بهتر است که اکسین ها را در هیدروکسید سدیم یا هیدروکسید پتاسیم 0.1 مولار ابتدا حل نموده ، سپس با آب مقطر به حجم برسانیم.​

عمل اکسین در گیاه:​

ü نور گرایی​

ü زمین گرایی​

ü تشکیل لایه زاینده​

ü عامل ریشه زایی​

ü رشد سلول ها​

ü غالبیت انتهایی​

ü پارتنوکارپی یا تولید میوه بدون هسته​

ü تنک کننده​

سیتوکینین ها : بیشتر شامل مشتقات آدنین می باشد و نقش مهمی در القای ساقه زایی دارد. یادآور می شود که نسبت کم سیتوکینین به اکسین سبب ریشه زایی می شود. سیتوکینین ها را نیز در هیدروکسید سدیم یا هیدروکسید پتاسیم 0.1 مولار ابتدا حل نموده ، سپس با آب مقطر به حجم می رسانیم. از دو سیتوکینین مصنوعی ( کینیتین و بنزل آدنین) به وفور در کشت بافت استفاده می شود.لازم به ذکر است که سیتوکینین های مصنوعی در برابر نور و دما پایدار ترند.​

عمل سیتوکینین ها:​

ü سیتوکینز و تقسیم سلولی​

ü تاخیر در وقوع پیری​

ü ساقه زایی​

ü تسریع جوانه زنی و شکستن خواب​

ü ضد غالبت انتهایی​

ü ضد تخریب کلروفیل​

ü ایجاد پارتنوکارپی در برخی موارد​

جیبرلین: همانطور که پیش تر گفته شد، از این مواد به اندازه اکسین ها و سیتوکینین ها در کشت بافت استفاده نمی شود. جیبرلین ها محلول در آب هستند و به صورت استوک 100X نگهداری می شوند.از معروف ترین جیبرلین ها ، GA3 می باشد که استفاده زیادی در باغبانی دارد.. این مواد نسبت به دما بسیار حساس هستند.​

عمل جیبرلین:​

ü جلوگیری از اندام زایی​

ü افزایش فاصله میانگره ها​

ü رشد طولی سلول ها​

ü ایجاد پارتنوکارپی​

آبسزیک اسید: استفاده چندانی در کشت بافت ندارد ولیکن در القای جنین زلیی سوماتیکی کاربرد دارد. معمولا آبسزیک اسید نقشی بازدارنده و منفی در گیاه دارد که با استفاده از ذغال فعال می توان آبسزیک اسید را حذف کرد.​

عمل آبسزیک اسید:​

ü ایجاد پیری زودرس​

ü مشوق ایجاد خواب در بذور​

ü ریزش برگ و میوه​

اتیلن: هورمونی گازی شکل است که معمولا به محیط کشت اضافه نمی شود چون خود گیاه، پس از مدتی تولید اتیلن خواهد کرد.​

◙ نکته: کشت اندام و کشت کالوس قادر به تولید اتیلن می باشند و همچنین ظروف پلاستیکی و شعله اتیلن تولید می کنندکه می توان با استفاده از پرمنگنات پتاسیم و پرکلرات جیوه [این دو ماده اسکرابر یا جاذب اتیلن هستند] اتیلن را از بین برد.​

افزودن اتیلن به محیط کشت سبب تشکیل پیاز های نابجا در برخی گیاهان می شود. لازم به ذکر است که در برخی از کشت های سوسپانسیون سلولی ، 2,4,D ، اتیلن تولید می کند.​

◄ چه مواقعی استوک تهیه می کنیم؟​

برای عناصر ماکرو ، میکرو ، ویتامین ها ، هورمون های اکسین و سیتو کینین استوک می سازیم و برای قند هیچ وقت استوک تهیه نمی کنیم بلکه به صورت جامد ( پودر ) استفاده می کنیم.​

آگار و مواد منعقد کننده​

آگار با غلظتی حدود 0.6 تا 0.8 درصد و در مراحل انتهایی تهیه محیط کشت افزوده می شود. در کشت پروتوپلاسم از آگاروز به جای آگار استفاده می شود [درصد خلوص آگاروز بالاتر از آگار است و ژله آگاروز شفاف تر است].​

از سایر مواد منعقد کننده می توان به ژل رایت و آلزینات را نام برد. ژل رایت با غلظتی حدودا نصف آگار به کار می رود و انعقاد آن بستگی به دادن حرارت و میزان کاتیون های نمک های دو ظرفیتی دارد.​

◙ نکته مهم: در کشت مایع ( سوسپانسیون سلولی) که آگار افزوده نمی شود و همچنین در محیط کشت های جامدی که غلظت آگار کم است، عارضه شیشه ای شدن (Vitrification)بافت ها به دلیل تجمع آب در سلول ها رخ می دهد که در صورت ادامه داشتن، منجر به مرگ سلول ها می شود.​

افزودن آگار بیش از حد، موارد زیر را موجب می شود :​

o شیشه ای شدن کمتر می شود.​

o ساقه های جانبی کمتر رشد می کنند.​

o پتانسیل ماتریک تغییر می کند و جذب آب دچار اختلال می شود.​

o جذب مواد غذایی کمتر می شود.​

اسید های آمینه​

افزودن اسید های آمینه به عنوان منبع ازتی در محیط کشت ضرورتی ندارد ولی در برخی از کشت ها نظیر کشت جنین ، اسید آمینه گلوتامین، افزوده می شود . همچنبن در برخی موارد برای از بین بردن مواد فنولی و دانه های رنگی از اسید های آمینه استفاده می شود.​

◙ نکته مهم: تجمع مواد رنگی و فنولی در محیط کشت منجر به کاهش زشد ، عدم باز زایی و از بین رفتن گیاه می شود. برای حذف مواد فنولی و دانه های رنگی علاوه بر اسید های آمینه ، از ذغال فعال ، پلی وینیل پیرولیدون ، ویتامین ث استفاده می شود.​

 

[hortilover]

همچنین محیط کشت مایع ، واکشت مداوم ، کاهش غلظت نمک ، کاهش تنظیم کننده های رشد و هورمون ها ، به حذف مواد رنگی و فنولی کمک شایانی می کند.​

ترکیبات مکمل کمپلکس ، شامل تریپتون ها ، پپتون ها ، عصاره های مخمر ، عصاره های مالت ، شیر نارگیل، هیدرولیزات کازئین و.... به دلیل زیر محدود می باشد :
◘ این ترکیبات ، تقریبا نامشخص و بسیار متغیر هستند.
◙ نکته مهم: از ذغال فعال در موارد زیر استفاده می شود:
ü جذب پیگمان های رنگی مثل ملانین
ü جذب ترکیبات آلی مثل هورمون ها
ü تاریک کرئن محیط کشت که باعث افزایش تشکیل ریشه می شود.
ü تحریک جنین زایی سوماتیکی ( غیر جنسی)
ü تثبیت PH
ü افزایش رشد سلول ها
انواع محیط کشت
محیط کشت هایی که بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند عبارتند از : M.S ، گامبورگ ، وایت ، ناب ، هلر، نیچ ، نیومن و ....غلظت نمک در محیط کشت M.Sبالا می باشد و در محیط کشت ناب کمترین غلظت نمک را شاهد هستیم.لذا در هنگام کشت گیاهان حساس به شوری ، از محیط کشت های هلر و ناب استفاده می کنیم و یا اینکه می توانیم غلظت نمک محیط کشتM.S را به نصف تقلیل داد. کاربرد و نوع محیط کشت مورد استفاده بستگی به نوع ، سن ، ریزنمونه دارد.
طریقه تهیه محیط کشت
برای این کار از محلول های استوک ( استوک عناصر ماکرو ، میکرو ، منیزیوم ، آهن ، ویتامین ها ، اکسین ، سیتوکینین ) بهره می گیریم. نحوه تهیه محیط کشت M.S بدین ترتیب است که ابتدا در یک ارلن مایر یک لیتری ، 800 سی سی آب می ریزیم، سپس با توجه با توجه به دستورالعمل های محیط کشت M.S، مقادیری از استوک عناصر ماکرو و میکرو را برداشته ، به همراه آب مقطر اضافه می کنیم. سپس استوک هورمون ها و ویتامین ها را اضافه می کنیم. باید توجه شود که هورمون ها و ویتامین های حساس به حرارت را پس از اتوکلاو نمودن محیط کشت ، اضافه کنیم.[ استوک ویتامین ها و هورمون ها از قبل توسط صافی استریل شده باشد].
پس از اجرای مراحل فوق ، قند را بصورت پودر و سایر مواد آلی اضافه می گردد. توجه شود که ارلن حاوی محیط کشت باید روی همزن مغناطیسی قرار گرفته باشد و دائما در حال تکان خوردن باشد.قبل از اینکه آگار (منعقد کننده) را اضافه کنیم باید PH را روی 5.5 تا 5.8 تنظیم کرد. [ عمل تنظیم PH با استفاده از هیدروکسید سدیم 0.1 مولار انجام می شود ]
عمل تنظیم PH بسیار مهم است چون اگر PH محیط کشت بالاتر از6 باشد، رشد مطلوبی صورت نمی گیرد و اگر PH خیلی پایین رود، اکسین و جیبرلین ناپایدار می شود، ویتامین تیامین ناپایدار ، محیط کشت آبکی و احتمال ویتریفیکاسیون بیشتر می شود. .
پس از تنظیم PH ، آگار را اضافه می کنیم ، البته دقت شود که قبل از اضافه کردن آگار ، حتما محیط کشت را حرارت دهید ( تا نزدیک نقطه جوش) تا حلالیت آگار بیشتر شود.
پس از اضافه کردن آگار ، توسط همزن مواد را مخلوط می کنیم تا تا محلولی شفاف به دست آید. حال محیط کشت را به درون ویال ها ( شیشه های مورد استفاده) انتقال می دهیم و نهایتا ویال ها را در دستگاه اتوکلاو ( به منظور استریل کردن) قرار می دهیم .
روش های استریل سازی در کشت بافت
کلیه مواد مورد استفاده ، دستگاه ها و هر آنچه که در حین عمل کشت بافت با آن سرو کار داریم را باید 100 درصد استریل کنیم. برای استریل سازی ریز نمونه از تیمار های شیمیایی استفاده می کنیم.
روش استریل سازی ریز نمونه:
ریزنمونه را توسط آب به خوبی شستشو می کنیم.پس از رفع آلودگی های ظاهری ریز نمونه را در الکل اتانول 70% به مدت 30 تا 60 ثانیه( بسته به نوع ریزنمونه) ، قرار می دهیم. اگر ریز نمونه بذر باشد ، مدت بیشتری نسبت به ریزنمونه برگ در الکل می گذاریم. (ریز نمونه خشبی نیز بیشتر در الکل باقی بماند) باید دقت شود که نگهداری ریز نمونه به مدت زیاد در اتانول ، ریزنمونه رشد و باززایی نمی کند.
سپس ریز نمونه را با آب مقطر می شوئیم ، در محلول هیپوکلریت سدیم ( وایتکس 1 تا 5 درصد ) به مدت 5 تا 30 دقیقه قرار می دهیم. سپس چندین بار ریز نمونه را با آب مقطر می شوئیم تا کاملا هیپوکلریت سدیم از ریزنمونه زدوده شود . حال ریز نمونه به درون هود لامینار انتقال می یابد
◙ نکته: در هنگام استریل سازی نمونه با هیپوکلریت سدیم ، از مواد کاهنده کشش سطحی ( یک قطره مایع ظرفشویی) استفاده می کنیم تا سطح تماس ریزنمونه با ماده ضدعفونی کننده افزایش یابد.
روش استریل کردن ظروف شیشه ای
بهتر است ظروف مورد استفاده پیرکس باشد چون که ظروف شیشه ای ارزان قیمت منجر به تولید مواد سمی می گردند.
ضدعفونی کردن ظروف توسط دستگاه اتوکلاو انجام میشود. سرعت و سهولت از بین بردن ویروس ها از مزایای اتوکلاو است. ظروف را به مدت 15 تا 30 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگرا د و در فشار 15 psiقرار می دهیم.
استریل کردن محیط کشت و محلول ها
عموما محیط کشت توسط اتوکلاو استریل می شود. ولی موادی را که توسط حرارت تجزیه می شوند ، با صافی استریل می کنند. شرایط 15 تا 30 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگرا د و در فشار 15 psi در اتوکلاو حکم فرماست . توجه شود که حجم های زیادتر محیط کشت را مدت زمان بیشتری در اتوکلاو می گذاریم. قند ها از جمله ساکاروز ، هورمون هایی مثل زآتین ، جیبرلین و اکثر ویتامین ها به حرارت حساس می باشند لذا توسط صافی آن ها را استریل می کنیم. هر چند ساکاروز را تا حدی می توان اتوکلاو نمود.
▼ توجه به نکات زیر در هنگام اتوکلاو نمودن محیط کشت ضروری است:
ü PH محیط کشت بعد از اتوکلاو نمودن ، 0.3 تا 0.5 کاهش می یابد یعنی محیط کشت کمی اسیدی تر می شود
ü اتوکلاو کردن طولانی مدت سبب رسوب برخی نمک ها و تجزیه آگار و قند ها می شود
ü مواد فرار از قبیل اتر ، اتیلن و ... در اثر اتوکلاو نمودن از بین می روند.
استرلیزاسیون لوازم فلزی از قبیل پنس و اسکالپل: این گونه وسایل را جهت ضد عفونی ، در دستگاه آون در دمای 170 تا 180 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت قرار می گیرند .
با استفاده از ا اشعه ماوراء بنفش می توان هود لامینار را ضد عفونی کرد. همچنین کف هود لامینار را با الکل 96 درصد ضد عفونی می کنند . لازم به ذکر است که پنس ها ، چاقو ها و دیگر لوازم فلزی را در زیر هود لامینار دو بار در الکل 70 درصد به مدت چند ثانیه فرو می برند و سپس بر بروی شعله می گیرند تا کاملا استریل گردد.
اگر با وجود ضد عفونی و استریل سازی ریزنمونه ، آلودگی مشاهده شد یکی از عوامل زیر مسئول می باشند:
§ آلودگی های داخلی بافت
§ بی دقتی در کار و یا ضد عفونی نکردن میز یا هود لامینار
§ الکل آلوده
§ صحبت کردن در زیر هود لامینار
§ رفت و آمد زیاد بهاتاق کشت​

 

[hortilover]

آلودگی ها داخلی
توسط استریل سازی با تیمار شیمیای برطرف نمی شوند و منجر به رشد ضعیف یا کلروز بافت های میش وند. این آلودگی ها اغلب در اثر باکتری های میله ای شکل ایجاد میشوند. دو راه برای مبارزه ، پیشنهاد می شود: اولا استفاده از آنتی بیوتیک در محیط کشت و ثانیا استفاده از کشت مریستم. لازم به ذکر است که به کاربردن آنتی بیوتیک به دلیل ایجاد مقاومت در باکتری ها ، هزینه زیاد و ایجاد سمیت گیاهی ، توصیه نمی شود.
مراحل اصلی انجام کشت بافت های گیاهی
1) تهیه ریز نمونه و استریل سازی آن
2) انتقال ریز نمونه به محیط کشت در زیر هود لامینار
3) رشد گیاه در محیط کشت تحت شرایط کنترل شده
4) واکشت کردن ریز نمونه ها
5) سازگار کردن ریزنمونه ها با شرایط برون شیشه ای (invivo)
6) انتقال گیاه به شرایط برون شیشه ای
جدا کردن و انتقال ریز نمونه استریل به درون محیط کشت
مقداری از ریز نمونه را بریده، در زیر هود لامینار به محیط کشت اضافه می کنیم. لوله های آزمایش و یا ظروف شیشه ای حاوی محیط کشت بایستی افقی نگه داشته شودو از قرار دادن ظروف محیط کشت بر روی شعله در حین انتقال نمونه خودداری شود، زیرا شعله تولید اتیلن می کند. معمولا بذور را بر روی سطح محیط کشت و اندام های گیاهی را درون محیط کشت قرار می دهند.

رشد گیاه در محیط کشت تحت شرایط کاملا کنترل شده
دمای محیطی که محیط کشت های حاوی ریز نمونه ها در آن قرار دارند، باید 24 تا 28 درجه سانتیگراد باشد ( البته در مواردی مانند گونه های پیاز دار ، شکستن خواب و یا جوانه زنی ، دمای کمتری را انتخاب می کتتد) .از لامپ های فلورسنت برای تامین نیاز نوری گیاه بهره می گیرند، نور بالاتر از 10000 لوکس مفید نمی باشد.چون نور زیاد، PH محیط کشت را پایین می آورد و محیط کشت را آبکی می کند.، دما را بالا می برد و اثرات منفی بر روی رشد گیاه ایجاد می کند.
در برخی موارد کنترل طول روزنیز حائز اهمیت است. فرایند هایی نظیر گلدهی و خواب به طول روز حساس هستند. تشعشع پایین را می توان با اضافه کردن قند به محیط کشت جبران کرد. رطوبت اتاق رشد ( گراس چمبر) در شرایط کنترل شده قرار دارد. هرچند به دلیل بسته بودن درب ویال ها ، رطوبت اتاق تاثیر چندانی بر محیط کشت ندارد.
اکسیژن مورد نیاز ریز نمونه را می توان با استفاده از سرپوش های فلزی برای ویال ها و همچنین قرار دادن ریز نمونه به صورت واژگون در محیط کشت ، استفاده از محیط کشت مایع ، تامین کرد.
واکشت کردن ریز نمونه ها
جدا کردن قطعه ای از ریز نمونه موجود در محیط کشت و کشت کردن مجدد آن در محیط کشت جدید را واکشت کردن می گویند. علت انجام این عمل عبارتست از:
ü کاهش مواد غذایی در محیط کشت اول
ü بالا رفتن غلظت نمک ها و خشک شدن محیط کشت اول
ü پر شدن فضا در اثر رشد گیاه در محیط کشت اول
ü ترشح مواد سمی و فنولی توسط گیاه به محیط کشت اول
ü کاهش PH و آبکی شدن محیط کشت اول
◙ نکته: گاهی اوقات هدف از واکشت کردن ، به همراه تغییر در میزان هورمون ها ی اکسین و سیتوکینین ، تولید اندام ریشه یا ساقه می باشد.
◙ نکته:گیاهانی که در شراسط درون شیشه ای رشد کرده اند ، ریشه های موئین بسیار کم و ضعیفی تولید کرده اند. یکی از بهترین کار هایی که به منظور توسعه ریشه ها استفاده می شود ، استفاده از محیط کشت مایع است.
سازگار کردن ریزنمونه ها با شرایط برون شیشه ای (invivo)
از آنجایی که ریز نمونه ها در شرایط درون شیشه ای با رظوبت بالا رشد کرده اند، بهببود مکانیسم باز و بسته شدن روزنه ها ، یکی از مهمترین فواید سازگاری گیاهان است در هنگام انجام عملیات سازگاری یا خودهی ، دما و نور را پایین و رطوبت را بالا نگه می داریم.
مراحل انتقال گیاه خو گرفته ، به شرایط برون شیشه ای
ü آگار از اطراف گیاه کاملا شسته شود.
ü انتقال به درون خاک کاملا استریل ( خاک را معمولا با آون ، بخار آب و یا اشعه استریل می کنند )
ü گیاهانی که در آنها پیاز های حقیقی یا کاذب وجود دار ، باید به فرم پیاز از ویال به درون خاک منتقل شود تا احتمال بقای گیاه بالاتر رود.
ü گاهی اوقات لازم است به منظور شکستن خواب گیاه ، بلافاصله پس از کشت گیاه در خاک به آن مقداری سرما بدهیم.

 

[hortilover]

ریز ازدیادی و مراحل آن ( Micro propagation )​

تکثیر کلون ها ( سلول های مشابه که از طریق غیر جنسی به وجود آمده اند)در شرایط درون شیشه ای را ریز ازدیادی گویند. مراحل مختلف ریزازدیادی عبارتست از :​

انتخاب ریز نمونه و استریل کردن آن و انتقال به محیط کشت​

تولید و تکثیر ساقه از ریز نمونه​

انتقال ساقه های تشکیل شده به محیط کشت برای ریشه دهی​

سازگاری و انتقال به خاک​

انواع روش های ریز ازدیادی​

اندام زایی​

تکثیر جوانه جانبی​

جنین زایی سوماتیکی​

اندام زایی یا ارگانوژنز​

به دو روش مستقیم و غیر مستقیم انجام می شود. مستقیم از جوانه نابجا اندام تولید و در روش غیر مستقیم از کالوس ، اندام تولید می شود.​

اندام زایی غیر مستقیم ( کشت کالوس)​

معمولا ریز نمونه هایی دارای سلول های فعال میتوزی برای تولید کالوس مناسب هستند. بنابر این بافات های مریستمی برای این کار ارجح ترند.. هر چه ریز نمونه بزرگ تر باشد ، امکان اندام زایی بیشتر می شود. همچنین بهتر است ریز نمونه از بافت جوان ، عاری از بیماری انتخاب شود محیط کشت هایی مثل MS ،گامبورگ ، وایت برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند.​

◙ نکته: محیط کشت مایع برای اندام زایی نسبت به محیط کشت جامد ارجحیت دارد چون در کشت مایع محیط کشت دائما به هم می خورد و شیب مواد غذایی یکسانی دارد. همچنین میزان تماس ریز نمونه با مواد غذایی و اکسیژن در کشت مایع بیشتر می شود.​

به منظور اندام زایی غیر مستقیم در محیط کشت مایع، ابتدا قطعه ای از ریز نمونه را بر محیط کشت بدون آگار می گذاریم و شیشه را بر روی شیکر ( 150 تا 200 دور بر دقیقه) قرار می دهیم.و محیط کشت دائما در حال بهم خوردن باشد تا اینکه پس از 2 تا 4 هفته کالوس مشاهده شود.​

نقش اصلی را در عمل اندام زایی هورمون ها بازی می کنند . مخصوصا اکسین و سیتوکینین که نسبت این ها ، تعیین کنننده نوع اندام ریشه یا ساقه می باشد. معمولا گیاهان تک لپه اکسین بیشتری به منظور القای کالوس نیاز دارند.​

عوامل موثر در اندام زایی​

• میزان هورمون اکسین و سیتوکینین​

• غلظت نمک ها ، هر چه نمک ها بیشتر باشند اندام زایی نیز بیشتر می شود.​

• غلظت یون آمونیوم نیز هر چه بیشتر ( البته نه خیلی زیاد ! ) باشد ، اندام زایی بیشتر می شود.​

• گاهی عوامل فیزیکی مثل جریان الکتریسیته بین ریز نمونه و محیط کشت می تواند اندام زایی را تسریع کند.​

اندام زایی مستقیم ( توسط جوانه نابجا )​

در این روش ابتدا جوانه نابجا ابتدا تشکیل می شود و سپس از این جوانه ها اندام ها ی ریشه و ساقه نابجا تشکیل می شود. تکثیر جوانه جانبی شامل کشت مریستم انتهایی ، کشت تک گره و کشت جوانه جانبی می باشد.​

کشت مریستم انتهایی​

عموما از این روش برای تکثیر گیاهان عاری از ویروس استفاده می شود. زیرا که مریستم انتهایی فاقد ویروس می باشد. این روش به دلیل ضعیف بودن غالبیت انتهایی و بالا بودن قابلیت ریشه دهی در گیاهان علفی ، نسبت به گیاهان چوبی بیشتر موثر است.​

کشت تک گره( جوانه)​

دراین روش جوانه جانبی همراه باقطعه ای از ساقه جدا می شود. هدف از این کشت ، رشد اندام هوایی از جوانه می باشد​

در این روش ، جوانه های تشکیل شده در زاویه دمبرگ ها و برگ های جوان را به عنوان ریز نمونه جدا می کنند و پس از تولید اندام رویشی و شاخه های کافی آن ها را ریشه دار نموده و نهایتا پس از مرحله سازگاری، آن ها را به خاک منتقل می کنند. توجه به نکات زیر، ضروری است:​

 وقتی که با گباهان روزت مثل ژربرا یا گیاهان خانواده بروملیاسه سروکار داریم، یا زمانی که امکان آلودگی زیاد باشد، استفاده از روش کشت تک جوانه، امکان پذیر نیست. برای گیاهان روزت از روش کشت جوانه جانبی به جای کشت تک گره استفاده می کنند.​

 بهترین جوانه ها برای کشت ، به منظور جلوگیری از آلودگی ، جوانه بسته می باشد.​

 سرعت تکثیر یا ریز ازدیادی بستگی به تعداد جوانه های موجود بر روی گیاه اولیه دارد.​

 در هنگام کشت تک جوانه ، خواب جوانه، ممکن است دردسر ساز شود . البته روش هایی برای شکستن خواب جوانه خصوصا برای گیاهان چوبی وجود دارد.که عبارتند از:​

 تیمار با درجه حرارت پایین​

 تیمار با روز بلند​

 تیمار با جیبرلین و یا سیتوکینین​

 اتیوله سازی ( تاریک کردن)​

روش کشت جوانه جانبی​

در این روش نوک ساقه جانبی را به عنوان ریز نمونه جدا می کنند . و گیاه اولیه را با غلظت زیاد سیتوکینین مواجه می کنند. غلظت بالای سیتوکینین، موجب توقف خاصیت غالبیت انتهایی شده و به جوانه های جانبی اجازه رشد می دهد.​

پس از تولید تعداد زیادی جوانه جانبی ، هر کدام را می توان جدا کرده و به محیط کشت جدید حاوی سیتوکینین انتقال می دهیم. حتی الامکان از سرشاخه های کوچک و جوان استفاده کنید تا خطر بروز آلودگی ها کمتر شود.​

◙ چند نکته مهم در مورد کشت جوانه جانبی​

 غلظت سیتوکینین مصرفی در این روش به سن بافت ریزنومنه بستگی دارد بدین معنی که هر چه ریزنمونه جوان تر باشد، سیتوکینین کمتری می طلبد.​

 اغلب گیاهان به سیتوکینین بنزل آدنین نسبت به سایرین، واکنش بهتری دارند.​

 نسبت سیتوکینین به اکسین را معمولا 10 به 1 در نظر می گیرند.​

 استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی گاهی اوقات تشکیل ساقه های جانبی را تسریع می کند.​

 از دو ترکیب فنیل اوره و تیدیازورون، به عنوان جایگزین های سیتوکینین می توان بهره گرفت.​

جنین زایی سوماتیکی​

هر یک از سلول های کیسه جنینی و یا بافت اسپورفتیک پیرامون آن ، قابلیت تبدیل شدن به جنین را دارا می باشند.​

جنین زایی سوماتیکی با اندام زایی متفاوت است زیرا در جنین زایی ، جنین فقط از یک سلول به وجود می آید و فاقد ارتباط آوندی با بافت کالوس میباشد. و جنین زایی سوماتیکی به یک محرک هورمونی (2,4,D) نیاز دارد ، در حالی که در اندام زایی به دو محرک هورمونی ( اکسین و سیتوکینین ) نیاز است.​

عوامل موثر بر جنین زایی سوماتیکی​

برای القای جنین زایی ، 2,4,D لازم است ولیکن برای رشد جنین 2,4,D ر احذف می کنیم.​

جیبرلین مانعی در تولید جنین در این روش می باشد.​

کاهش یون آمونیوم ، پتاسیم، کلسیم به تولید بهتر جنین کمک می کند.​

غلظت بالای نمک ها ، نور و دمای زیاد جنین زایی را تسریع می کند.​

غلظت ساکاروز برای جنین زایی سوماتیکی حدود 2 تا 3 درصد باشد.​

شیرنارگیل باعث تسریع جنین زایی می شود.​

◙ نکات مربوط به جنین زایی سوماتیکی​

در برخی از گیاهان مثل هویج می توان از تمامی اعضای گیاه به منظور جنین زایی استفاده کرد ولی در برخی از موارد فقط اندام خاصی از گیاه را باید تکثیر کرد.​

اندام های زایشی و بافت گل ، ریز نمونه های خوبی برای جنین زایی سوماتیکی هستند.​

▼ چرا از جنین زایی سوماتیکی ، در ریز ازدیادی کمتر استفاده می شود؟​

احتمال بروز جهش در جنین زایی سوماتیکی بالاست.​

تکثیر به وسیله این روش دشوار است.​

ممکن است گاهی در جنین زایی سوماتیکی ، جنین به خواب رود که شکستن آن بسیار دشوار است.​

 

[hortilover]

بذور مصنوعی
یکی از مهمترین موارد استفاده از جنین زایی سوماتیکی ، تولید بذور مصنوعی است. بذر مصنوعی عبارتست از یک جنین سوماتیکی به همراه یک آندوسپرم مصنوعی و یک پوشش مصنوعی برای حفاظت از بذر.
نقش آندوسپرم را ترکیباتی چون هیدروژل ، آگار ، آلژینات سدیم ، آلژینات پتاسیم و یا کاراجینان را ایفا می کنند . و برای پوشش بذر از کلرید کلسیم ، کلرید کبالت ، کلرید آهن ، دکستران و یا گزانتام استفاده می کنند. معمولا در صنعت از آلژینات سدیم به عنوان آندوسپرم و از کلرید کلسیم به عنوان پوشش بذر استفاده می شود.
مشکلات تهیه بذر مصنوعی
o نیاز به روش های فیزیکی و شیمیای جهت غیر فعال کردن جنین دارد.
o بذور مصنوعی محتاج به محافظت در برابر خشک شدن هستند.
o بازیافت گیاهان حاصل از این بذور دشوار است. دلیل این امر یکی به خاطر تشکیل جنین ناقص و دیگری به دلیل ایجاد آندوسپرم مصنوعی است.
o تولید آن هزینه بالایی دارد.
▼ چرا از روش بذور مصنوعی استفاده می کنیم؟
· مهمترین مزیت استفاده از این روش ، صرفه جویی در زمان می باشد. زیرا تولید بذر مصنوعی در مدت چند روز تاحد اکثر چند ماه به دست می آیند.
مزایای ریز ازدیادی
· به مقدار بسیار کمی از بافت گیاه به عنوان ریز نمونه ، نیاز می باشد.
· در برخی از گونه ها که به روش های رایج ، ازدیاد نمی شوند ، ریز ادیادی روش مناسبی است.
· در هر فصلی از سال قابل اجراست و تغییرات فصلی تاثیری در اجرای آن ندارد.
· توسط این روش گیاهان عاری از ویروس حاصل می شوند.
معایب ریز ازدیادی
o به تجهیزات گران و پیچیده نیاز دارد.
o امکان آلودگی گیاه توسط پاتوژن ها زیاد است.
o تغییرات ژنتیکی از جمله تنوع سوماکلونال ممکن است مشاهده شود که گاهی اثرات نامطلوبی بر جای می گذارد.
o امکان دارد برخی پیده های منفی نظیر شیشه ای شدن و یا پرپشت شدن رخ دهد​

کشت مریستم و روش های ایجاد گیاهان عاری از ویروس
همانطور که قبلا نیز ذکر شد یکی از روش های مبارزه با آلودگی های درونی ، کشت مریستم می باشد که شامل 6 روش می باشد.
1. استفاده از گرما
2. کشت مریستم
3. تلفیق گرما و کشت مریستم
4. تشکیل جوانه نابجا و اندام هوایی و سپس کشت مریستم
5. کشت کالوس و پروتوپلاست
6. پیوند مریستم روی پایه های عاری از ویروس
استفاده از گرما
به نظر می رسد که گرما فقط علیه ویروس های ایزومتریک . بیماری های ناشی از مایکوپلاسما موثر است و گاهی گرما روی برخی ویروس ها کاملا بی اثر است. استفاده از این روش برای درختان میوه ای که به کشت مریستم جواب نمی دهند، مناسب می باشد.درجه حرارت مورد استفاده به نوع گیاه بستگی دارد ( بین 35 تا 38 درجه سانتیگراد) و زمان آن بین 20 تا 40 روز توصیه می شود.
◙ نکته مهم : این روش برای گیاهان کشت شده در شرایط درون شیشه ای مناسب است و طبیعی است که گیاهان در شرایطinvivo قادر به تحمل چنین گرمایی، نیستند !
کشت مریستم: فرضیه های مختلفی در باره عدم وجود در مریستم ها گزارش شده است، از جمله:
1. در هنگام تقسیم سلولی ، گیاه ظرفیت برای سنتز اسید های نوکلئوتیک، به مصرف خود گیاه رسیده درنتیجه ویروس ها نمی توانند تکثیر شوند.
2. فقدان بافت های آوندی در مریستم و همچنین فقدان فضای سلولی مانع انتقال ویروس می شود.
3. آنزیم های مورد نیاز برای تکثیر ویروس در مریستم ها وجود ندارد.
4. غلظت کم ویروس ها در مریستم در نتیجه وجود برخی بازدارنده های طبیعی است.
نحوه کشت مریستم بدین صورت است که ابتدا قسمت انتهایی اندام هوایی ( مریستم ) را جدا می کنیم و بر روی محیط کشت قرار می دهیم.در هنگام جدا کردن ریز نمونه اگر مریستم فعال باشد ، شانس حذف ویروس بیشتر می شود. معمولا مریستم را همراه با یک تا دو جوانه آغازین برگ ، توسط اسکالپل قطع می کنیم شانس موفقیت کشت مریستم به نوع و موقعیت جوانه ها و همچنین فصل رشدی که ریز نمونه جدا می شود بستگی دارد.یعنی مثلا اگر در بهار ، مریستم ها را جدا کنیم ر به خوبی گیاهان عاری از ویروس و تولید می شود.
ترکیبات محیط کشت برای کشت مریستم
معمولا مریستم ها در محیط کشت جامد کشت می شوند. PHمحیط کشت 5.4 تا 6 می باشد. از ویتامین های تیامین (B1) ، پیرودوکسین (B6) ، اسید نیکوتینیک (B3) و... در محیط کشت استفاده می شود .
هورمون با غلظت کم ( معمولا اکسین و سیتوکینین ) وساکاروز 2 تا 5 درصد استفاده می شود. درجه حرارت ه.ا ، 21 تا 25 درجه سانتیگراد ( البته در کشت مریستم گیاهان غده ای حرارت پایین تری انتخاب می شود)
استفاده تلفیقی از گرما و کشت مریستم
زمانی که بیش از یک نوع ویروس وجود داشته باشد از این روش بهره می گیریم. اغلب از گرما در ابتدای کشت مریستم استفاده می شود . طول دوره استفاده از گرما ( بین 35 تا 38 درجه سانتیگراد) معمولا بین 5 تا 10 هفته متغیر است.در این روش ابتدا از گرما استفاده می شود سپس از گیاهی که دوره گرما را سپری کرده است ، مریستم به عنوان ریز نمونه جدا می شود.
تشکیل ساقه یا جوانه نابجا و کشت مریستم
تشکیل جوانه نابجا و در نهایت ساقه نابجا برای بدست آوردن گیاهان عاری از ویروس بکار می رود. جدا کردن مناطق عاری از ویروس از گیاه و تولید ساقه های نابجا منجر به ایجاد گیاهانی عاری از ویروس می شود.
کشت کالوس و پروتوپلاست
می توان با جدا کردن قسمت های عاری از ویروس از گیاه ،کالوس یا پروتوپلاست های عاری از ویروس به دست آورد. البته باید دقت شود که گیاهان عاری از ویروس حاصل از کشت کالوس و کشت پروتوپلاست ، به دلیل موتاسیون ها و تغییرات زیاد، اهمیت کاربردی چندانی ندارند.
ریز پیوندی (پیوند مریستم روی پایه های عاری از ویروس) (Micro Grafting)
چنانچه امکان القای رشد مریستم یا تولید ریشه از ساقه حاصل از کشت مریستم وجود نداشته باشد، از ریز پیوندی بهره می گیریم. ریز پیوندی در گونه های چوبی بسیار مهم است چون در این گروه از گیاهان کشت مریستم امکان پذیر نمی باشد.
کشت جنین
عبارتست از جدا کردن و رشد دادن یک جنین نارس ، نابالغ و یا بالغ کاملا استریل در شرایط درون شیشه ای که هدف از انجام اینکار تولید یک گیاه کامل می باشد. اولین بار دانشمندی به نام هانیگ در سال 1904 توانست با استفاده از کشت جنین گیاه بدست آورد. به طور کلی دو نوع کشت جنین وجود دارد. کشت جنین بالغ و کشت جنین نا بالغ.
کشت جنین نابالغ
معمولا برای جلوگیری از سقط جنین نارس انجام می شود و به یک محیط کشت بسیار پیچیده نیاز دارد. احتمال موفقیت بستگی به مرحله نمو جنین دارد.
کشت جنین بالغ
برای رفع موانع جوانه زنی بذر از این روش استفاده می شود. جنین های بالغ بر روی محیط کشت قرار می گیرند و به یک محیط کشت ساده نیاز دارد.​

 

[hortilover]

مشخصات جنین در شرایط درون شیشه ای ، نسبت به برون شیشه ای پس از مرحله گلوبولار به صورت زیر است:
 جنین در شرایط درون شیشه ای رشد حجمی بیشتری دارد و گلابی شکل است.
 در شرایط درون شیشه ای ، در ابتدا تنها یک لپه وجود دارد در حالیکه در شرایط برون شیشه ای به طور همزمان ممکن است دو لپه موجود باشد.
 جنین های جدا شده در شرایط درون شیشه ای معمولا زود تر از موعد جوانه می زنند. این امر به دلیل عدم وجود پوسته بذر و مواد بازدارنده جوانه زنی در کشت درون شیشه ای است.
عواملی که در موفقیت کشت جنین دخالت دارند عبارتند از:
ژنوتیپ : در برخی از گونه ها و ژنوتیپ های گیاهی رشد جنین آسان می باشد و در برخی دیگر رشد جنین مشکل است.
مرحله نمو جنین هنگام جداسازی : جنین های بسیار کوچک و تمایز نیافته معمولا در برون شیشه رشد نمی کنند و جنین های تکامل یافته در شرایط برون شیشه راحت تر رشد می کنند.
شرایط رشد گیاه مادری : بهبود رشد گیاه مادری که جنین را از آن جدا می کنیم منجر به نمو و رشد بهتر آندوسپرم و همچنین رشد بهتر لپه ها می شود که نهایتا رشد جنین بهتر خواهد شد.
ترکیب محیط کشت: همانطور که قبلا ذکر شد، جنین نابالغ نسبت به جنین بالغ نیاز به محیط کشت پیچیده تری دارد. اگر جنین بالغ باشد از غلظت 2 تا 3 درصد و اگر جنین نابالغ باشد ، از غلظت 8 تا 12 درصد استفاده می کنیم.
◙ نکته : میزان نیاز قند با بزرگتر شدن جنین در واکشت های بعدی کاهش می یابد.
◙ نکته : از هورمون های اکسین و سیتوکینین در کشت جنین استفاده نمی کنیم زیرا این هورمون ها اندام زایی می کنند و به جای اینها می توان از جیبرلین بهره گرفت که باعث تسریع در جنین زایی می شود.
◙ نکته: در محیط کشت از موادی مثل شیر نارگیل ، هیدرولیزات کازئین و عصاره مالت استفاده می شود که برای رشد جنین های نابالغ مفید می باشند.
◙ نکته: وجود گلوتامین برای رشد جنین های نابالغ ضروری است . معمولا اسید مالیک نیز به محیط کشت جنین اضافه می شود.
پس از یک تا دو هفته که رشد جنین انجام شد ، جنین از رشد باز می ایستد و باید جنین را واکشت نمود و به محیط کشت جدیدی که محتوی مقدار قندی آن در حد معمول و مقدار کمی اکسین و سیتوکینین است ، انتقال می دهیم ( در محیط کشت اولیه از اکسین و سیتو کینین استفاده نمی کنیم ) در این حالت در بیشتر موارد به طور مستقیم ساقه و اندام های هوایی تشکیل می شود . در برخی موارد که جنین به تشکیل مستقیم ساقه نمی پردازد، باید ریز نمونه را به محیط کشت دیگری منتقل کرد.
اکسیژن : در برخی از موارد نیاز کشت جنین به اکسیژن بیش از غلظت موجود در هواست که باید نسبت به اضافه کردن اکسیژن به محیط اقدام کرد.
نور: در برخی از موارد لازم است که جنین های جدا شده به عنوان ریز نمونه به مدت یک تا دو هفته در تاریکی بگذرانند و پس از آن به منظور تشکیل کلروفیل در روشنایی قرار می گیرند.
درجه حرارت : درجه حرارت معمولا به گونه جنین بستگی دارد. معمولا برای کشت جنین درجه حرارت نسبتا بالا ی 25 تا 28 درجه استفاده می شود.
موارد کاربرد کشت جنین
 رفع موانع جوانه زنی بذور
 کوتاه کردن دوره اصلاح گیاهان با رفع خواب بذر
 تولید گیاهان هاپلوئید
 جلوگیری از سقط جنین در درختان هسته دار زودرس مثل گیلاس ، آلبالو ، زرد آلو.
 جلوگیری از سقط جنین در اثر ناسازگاری حاصل از تلاقی های بین گون های.
 تکثیر رویشی ، گاهی از جنین به عنوان ماده اولیه برای تکثیر رویشی استفاده می شود که این حالت بیشتر در خانواده گندمیان و مخروطیان امکان پذیر است.
کشت سوسپانسیون سلولی
در این نوع کشت ها ، ریز نمونه استریل از قبیل جوانه ، جنین یا بافت ، درون محیط کشت مایع قرار داده می شوند. نحوه عمل بدین صورت است که ابتدا قسمتی از بافت را جدا کرده و به آرامی در محیط کشت مایع رها می کنیم و تحت تاثیر آنزیم های پکتیناز موجود در محیط کشت ، قرار می دهیم.( نقش این آنزیم انحلال پکتین در دیواره سلولی است) لازم به ذکر است که از محیط های کشت M.S ،LS ، Blaydez ، B5 ، استفاده می کنیم.و این محیط کشت ها برای هوادهی دائما روی شیکر قرار دارند. به منظور واکشت کردن از دو روش استفاده می کنیم:
1. قبل از واکشت ، سوسپانسیون را از درون صافی های استریل عبور می دهیم.
2. اجازه دهیم برخی مواد در محیط کشت اولیه رسوب نمایند سپس با استفاده از پی پت موادی که هنوز به صورت سوسپانسیون هستند را به محیط کشت جدید انتقال دهیم.
سلول های کشت سوسپانسیون سلولی و همچنین کالوس ، در هنگام رشد خود، 5 مرحله زیر را طی می کنند:
1. مرحله خفته
2. مرحله تصاعدی
3. مرحله رشد خطی
4. مرحله کند شدن رشد
5. مرحله سکون
زمان مضاعف سدن سلول ها در کشت های سوسپانسیون سلولی از 24 تا 48 ساعت متغیر است و معمولا نباید بیش از 20 درصد حجم ظرف را پر کرد.​

 

[hortilover]

انواع کشت سوسپانسیون سلولی
 کشت بسته
 کشت مداوم که خود شامل دو دسته می شود:
کشت مداوم باز
کشت مداوم بسته
کشت بسته:
در این روش محیط کشت تجدید نمی شود.
کشت مداوم باز :
در این نوع سیستم محیط کشت تجدید می شود و همزمان با تجدید محیط کشت سلول ها هم برداشت می شوند.
سیستم کموستات : در این سیستم با ثابت نگه داشتن نیتروژن ، فسفر و گلوکز، مقدار رشد وتراکم سلول ثابت نگه داشته می شود و سایر مواد در حد متعادل نگه داشته می شوند.
سیستم توربیدوستات : در این سیستم ، محیط کشت با توجه به میزان کدری آن ، جایگزین می شود و تراکم سلول با استفاده از برداشت سلول ها از محیط کشت ثابت نگه داشته می شود.
محیط کشت مداوم بسته:
در این حالت محیط کشت تجدید می شود ولیکن سلول ها برداشت نمی شوند.
همزمان سازی کشت سوسپانسیون سلولی به منظور تولید متابولیت های ثانویه
یک کشت همزمان کشتی است که در آن کل چرخه سلولی و یا یک مرحله خاصی از چرخه سلولی اکثر سلول ها همزمان اتفاق می افتد. این همزمان کردن سبب یکنواختی رشد سلول ها می شود . روش زیر برای ایجاد همزمانی در کشت سوسپانسیون سلولی توصیه می شود:
 سرما دادن: قرار دادن محیط کشت در یخچال به مدت چند روز.
 گرسنگی دادن : کاهش دادن یا قطع یک فاکتور ضروری رشد که منجر به ایجاد فاز سکون می شود و سپس فراهم کردن مجدد همان فاکتور که موجب همزمانی مراحل رشد سلولی می گردد.
 استفاده از بازدارنده های شیمیایی مثل هیدروکسی اوره و ...
 استفاده از موادی نظیر کلشی سین که منجر به توقف رشد سلول ها در مرحله متافاز می شود.
تکنیک کشت تک سلول ( تکنیک برگمن در محیط کشت جامد)
برگمن در سال1960 برای اولین بار پخش سلول های کشت سوسپانسیون بر سطح محیط کشت آگار را ابداع کرد. در این روش سوسپانیون سلولی و آگار ، به طور جداگانه و هر یک با غلظت دو برابر تهیه می شود سپس مقادیر مساوی از سوسپانسیون سلولی و آگار در دمای 38 درجه سانتیگراد با هم ترکیب و سریعا به پتری دیش منتقل می شوند. به نحوی که سلول ها در لایه نازکی به ضخامت یک میلیمتر، پخش می شوند.
سوسپانسیون سلولی محیط کشت برگمن باید حتما رقیق باشد و پس از آن ظرف شیشه ای را با پارافین بسته و پتری دیش را در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت سه هفته درون انکوباتور قرار می دهیم.
کاربرد های کشت سوسپانسیون سلولی
 امکان تکثیر گیاهان مشابه را فراهم می کند
 از این نوع کشت جهت مطالعه و تحقیق بر روی سلول ها استفده فراوانی می شود.
 از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده در کشت سوسپانسیون سلولی جهت تولید گیاهانی با خصوصیات جدید بهره می برند.
 منبعی برای تولید متابولیت های ثانویه به شمار می آیند.
متابولیت های ثانویه
موادی هستند که مورد استفاده گیاهان واقع نمی شوند و نیز وارد سیکل های حیاتی گیاه وارد نمی شوندو اصلا فعالیت فیزیولوژیکی در گیاه انجام نمی دهند اما به منظور دفع آفات ، جذب حشرات و مبارزه با بیماری های گیاهی تولید می شوند.
بیوترانسفورماسیون
تغییر و تبدیل یک ماده بی ارزش به یک ماده مهم صنعتی با استفاده از سیستم های بیولوژیکی (کشت بافت و کشت سوسپانسیون سلولی) را بیوترانسفورماسیون گویند. سلول های گیاهی معمولا به دو روش در بیوترانسفورماسیون مورد استفاده قرار می گیرند:
1. استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی و اضافه نمودن ماده بی ارزش به محیط کشت و سپس برداشت محصول از محیط کشت پس از مدت زمان مناسب.
2. بی تحرک کردن سلول های گیاهی ( تثبیت سلول ها ) در ستون های حاوی ماتریکس ژله مانند ( جنس این ژل آلژینات سدیم یا پتاسیم است ). سوبسترا یا ماده بی ارزش از بخشی وارد ماتریکس می گردد و از طرفی دیگر ماده مورد نظر استخراج می شود.
مهم ترین واکنش هایی که سلول های گیاهی در بیوترانسفورماسیون انجام می دهند عبارست از: هیدروکسیلاسیون ، اکسیداسیون و احیا ، هیدرولیز ، گلیکولیزاسیون ، ایجاد باند مضاعف.
تولید گیاهان هاپلوئید با استفاده از کشت بساک و کشت تخمک
روش تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط برون شیشه ای با استفاده از عوامل زیر صورت می گیرد:
• بکرزایی
• نرزایی یا آندروژنز
• حذف ژنوم در تلاقی های دور
• سمی گامی
• تیمار شیمیایی مثل کلشیسین،مائیک هیدرازید و...
• درجه حرارت های بالا و پایین
• اشعه ایکس و ماورا بنفش
تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط درون شیشه ای با استفاده از عوامل زیر صورت می گیرد:
• کشت بساک
• کشت دانه گرده
• کشت گل آذین
• کشت تخمک
• کشت جنین​

کشت بساک
جداسازس بساک و استریل نمودن و قرار دادن آن بر روی محیط کشت را کشت بساک می نامند.بساک به عنوان ریز نمونه هنگامی جدا می شود که اولین تقسیم میتوز در دانه گرده رخ نداده است. و یا اینکه بساک دارای میکروسپور های تک هسته ای بین باشند.گیاهان هاپلوئید را می توان به دو روش از بساک های استریل تولید نمود. یکی روش مستقیم و دیگری روش غیر مستقیم. در روش مستقیم از دانه گرده ، مستقیما جنین به دست می آید .در روش غیر مستقیم ابتدا از دانه گرده کالوس تولید می شود سپس جنین یا ساقه نابجا تولید می شود. لازم به ذکر است که روش غیر مستقیم به دلیل تولید سطوح مختلف پلی پلوئیدی روش مناسبی نمی باشد.
کشت دانه گرده:
جداسازی دانه گرده ( میکروسپور ) از درون بساک و کشت آن در شرایط درون شیشه را کشت دانه گرده گویند. روش جدا سازی دانه گرده از بساک کمی مشکل است و شامل مراحل زیر است:
Ø ابتدا بساک ها را در مرحله مناسب جدا می کنند و با یک میله شیشه ای خمیده له می کنند. در این حالت دانه های گرده از بساک خارج می شوند.
Ø در این مرحله سوسپانسیون بساک ها به همراه دانه های گرده از صافی گذرانده می شوند.( قطر منافذ این صافی کمی بیش تر از قطر دانه گرده است)
Ø سوسپانسیون محتوی دانه گرده با دور کم 150 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ می شوند.و فاز رویی که محتوی مواد زاید می باشد به دور ریخته می شود.
Ø دانه های گرده رسوب کرده بر روی یک محیط کشت مناسب قرار داده می شوند. در نهایت سوسپانسیون حاصل با پیپت به پتری دیش منتقل می شود.
عوامل موثر در در موفقیت کشت دانه گرده و بساک
o ژنوتیپ گیاه
o وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والدی که از آن ریز نمونه گرفته می شود.
o مرحله رشد دانه گرده در هنگام جداسازی
o پیش تیمار بساک ها که شامل پیش تیمار سرمایی و پیش تیمار گرمایی و یا پیش تیمار شیمیایی می شود.
o محیط کشت که معمولا از درصد بالایی ، قند، گلوتامین ، نیترات و نمک ها آمونیومی ، ذغال فعال ، آهن و ... تشکیل شده است.

 

[hortilover]

مزایای کشت گرده نسبت به کشت بساک
 افزایش شانس باززایی گیاهان هاپلویید در کشت دانه گرده
 با حذف بساک مواد بازدارنده رشد و آبسزیک اسید حذف می شوند.
 در کشت دانه گرده ، بساک ها به عنوان مانع انتقال مواد غذایی از محیط کشت به دانه گرده نمی توانند اثری داشته باشند.
 امکان بروز شیمر در کشت دانه گرده کمتر استو
 برای القای موتاسیون و دست ورزی های ژنتیکی کشت دانه گرده مهم تر از کشت بساک می باشد.
 تشکیل جنین در کشت دانه گرده راحت تر و بهتر از کشت بساک است.
کاربرد های هاپلوئید ها
امکان رسیدن سریع به هموزیگوسیتی با ایجاد دبل هاپلوئید فراهم می شود.
امکان رسیدن سریع به هموزیگوسیتی در گیاهان در گیاهان با دوره گلدهی طولانی فراهم می شود.
.امکان تولید هیبرید های F1 یکنواخت فراهم می شود.
حصول هاپلوئیدی به منظور آسان کردن مطالعات توارث و خصوصیات مطلوب
تولید گیاهان نر در باغبانی امکان پذیر می شود. مثلا در مارچوبه عملکرد بوته های نر بیشتر است.
برای انجام هیبریداسیون سوماتیکی ، کار کردن با پروتوپلاست های هاپلوئید راحت تر از کار کردن با پروتوپلاست های دیپلوئید می باشد.
استفاده از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده در کشت بافت و ایجاد گیاهانی مقاوم به حشرات و ...
کشت تخمک
برای تولید گیاهاان هاپلوئید در گونه هایی که با کشت دانه گرده نتایج نامطلوبی چون آلبینیسم را به همراه دارد، یا مانند ژربرا با نارسایی همراه است، می توان از کشت تخمک یا تخمدان بهره گرفت. برای تولید گیاه هاپلوئید با استفاده از کشت تخمدان ، تخمک های بارور نشده جوانه گل ، 24 الی 48 ساعت قبل از گرده افشانی طبیعی جدا می شوند.قبل از کشت بخش انتهایی دمگل بریده می گردد وتخمدانرا از سمت بریده شده در محیط کشت قرار می دهند.
در کشت تخمدان معمولا از محیط کشت های وایت و نیچ و یا N6 استفده می کنند .مهمترین عیبی که این تکنیک دارد اینست که نسبت به کشت میکروسپور که تعداد بیشماری دانه گرده دارد، در هرگل فقط یک تخمدان وجود دارد..
کشت پروتوپلاست
در این کشت، پروتوپلاست جدا شده و در شرایط درون شیشه ای کشت می شود معمولا از سلول های مزوفیل برگ استفاده می شود در برخی از موارد از کشت سوسپانسیون سلولی برای تولید پروتوپلاست استفاده می گردد.در این صورت سلول ها در مرحله رشد تصاعدی برداشت می شوند. پس از انتخاب سلول ها ، دیواره سخت سلولزی را از بین می برند به منظور خالص کردن پروتوپلاست ها از ***** ها و سپس برای ته نشین کردن پروتوپلاست ها از سانتریفیوژ استفاده می کنند ( سانتریفیوژ مکرر با دور کم و در محلول ساکاروز 15 الی 20 درصد انجام می شود) سپس پروتوپلاست های جدا شده به منظور واکشت در محیط کشت جدیدی قرار داده می شوند.لازم به ذکر است که در محیط کشت نباید از آمونیوم استفاده کرد چون بقای پروتوپلاست را به مخاطره می اندازد. مقدار کلسیم در محیط کشت افزوده و از مقدار آهن و روی کاسته می گردد.معمولا غلظت اکسین را بالا تر و سیتو کینین را کم تر می کنند و محیط کشت را در تاریکی قرار می دهند.
امتزاج پروتوپلاست
یکی از مهمترین استفاده های کشت پروتوپلاست استفاده از آن در دو رگ های سوماتیکی و امتزاج پروتوپلاست است.
معمولا به منظور امتزاج پروتوپلاست ها ، دو گونه از طریق انکوباسیون پروتوپلاست ها در غلظت بالای PEG و در غلظت بالای کلسیم و همچنین محیطی قلیایی انجام می گیرد. به دلیل وجود بار های منفی در سطح پروتوپلاست دو گونه مختلف معمولا امتزاج آنها به سختی انجام می شود.که برای جلوگیری از این امر از موادی موسوم به فوزیژن ها ( شامل نیترات سدیم و کلرید کلسیم) استفاده می شود.ممکن است از روش الکتروفیوژن استفاده شود که در این روش ابتدا با شدت جریان کم، ابتدا پروتوپلاست ها به هم اتصال پیدا می کنند سپس با افزایش شدت در زمان کم ، عمل امتزاج روی می دهد.
پس از عمل امتزاج نوبت به باز زایی دیواره سلولی پروتوپلاست هیبرید می شود.بدین منظور باید غلظت کلسیم در محیط کشت را زیاد و پتانسیل اسمزی را کم کنیم.. بعد از چند روز که دیواره سلولی باز زایی شد ، پتانسیل اسمزی را به تدریج افزایش می دهیم تا به حد نرمال برسد. اگر پروتوپلاست ها از دو ژنوتیپ مختلف با هم ، امتزاج یابند هتروکاریون و اگر دو پروتوپلاست مشابه با هم امتزاج یابند، هوموکاریون حاصل می شود.
سیبرید ها
امتزاج بین هسته و سیتوپلاسم یک گونه با فقط سیتو پلاسم پروتوپلاست دیگر را سیبرید گویند. در ایجاد نر عقیمی ، مقاومت به بیماری و مقاومت به علفکش ها استفاده می شود​

 

[hortilover]

اهمیت .و کاربرد هیبریداسیون سوماتیکی
ü امکان تهیه هیبرید هایی که به روش معمولی نمی توانند به وجود بیایند.
ü تولید هیبرید در گیاهانی که اندام های جنسی در آنها غیر فعال است
ü تولید هیبرید در گیاهانی که هنوز در سن نونهالی هستند و یا به گل نرفته یا دیر گل هستند.
ü با استفده از این روش می توان اطلاعات موجود در والد نر ( ژن مقاومت به بیماری ها و...) را به نتاج منتقل کرد​

تنوع سوماکلونال
به تنوع و تغییرات ژنتیکی و کروموزومی ایجاد شده در کشت بافت تنوع سوماکلونال گویند. به گیاهان جدید و مقاومی که در اثر تنوع سوماکلونال به وجود می آیند واریانت گفته می شود. توجه شود که ایجاد واریانت جدید تنها در مورد صفات و ژن هایی نظیر مقاومت به بیماری ها و علفکش ها پاسخ مثبتی داده است و در مورد سایر صفات همیشه به صورت مفقیت آمیز نبوده است.​

منابع:
- مبانی کشت بافت گیاهی تالیف R.L.M ترجمه دکتر باقری و همکاران
- اصول بیوتکنولوژی گیاهی تالیف H.S​

 

[Phyto]

[h=1]کشت بافت گیاهی[/h]

..::دید کلی::..


وقتی درباره کشت گیاه صحبت می‌شود، معمولا منظور کشت گیاهان در گلدان ، زیر پلاستیک (Frames) ، در گلخانه و یا مزرعه است. در تقسیم بندیهای رایج در کشاورزی ، کشت گیاهان به بخشهای مختلف شامل زراعت ، باغبانی ، زراعت مناطق گرمسیری ، جنگل‌داری و اصلاح نباتات تقسیم می‌گردد. در سال ۱۹۰۴ هانیگ ، روش جدیدی از کشت گیاهان به نام کشت جنین را ارائه نمود.او جنین نابالغ تعداد زیادی از گیاهان تیره شب‌بو (cruci Ferae) را در شرایط کشت آزمایشگاهی (in Vitro) ایزوله کرد و از آنها ، گیاهچه‌های زنده بدست آورد. از سال ۱۹۲۰ انواع روشهای کشت بافت ، نظیر کشت آزمایشگاهی بذرهای ارکیده ، کشت کالوس ، کشت اندام مرسوم شد. بعد از سال ۱۹۴۵ ، به تمام روشهای مختلف کشت در آزمایشگاه ، کشت بافت گیاهی اطلاق گردید

انواع کشت بافت


​

کشت گیاه کامل: یک بذر ممکن است در شرایط آزمایشگاهی کشت شود و یک گیاهچه و در نهایت یک گیاه کامل تولید کند.
کشـت جــنین: در این نوع کشت ، جنین جدا شده و پس از حذف پوسته بذر ، کشت می‌شود.
کشت اندام گیاهی: در این کشت ، انواع مختلفی مثل کشت مریستم ، کشت ریشه ، کشت نوک ساقه قابل تشخیص هستند.
کشـت کــالوس: اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در شرایط آزمایشگاهی تولید یک توده سلولی تمایز نیافته به نام کالوس نماید، این پدیده را کشت کالوس می‌نامند.
کشـت سـلول: کشت سلولهای منفرد که به کمک آنزیمها یا به روشهای مکانیکی از یک بافت گیاهی یا سوسپانسیون سلولی بدست می‌آیند.
کشت پروتوپلاست: کشت پروتوپلاستهایی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلولی بوجود آمده‌اند، کشت پروتوپلاست نام دارد.

.:: موارد کاربرد کشت جنین ::.

​

رفع موانع جوانه‌زنی بذر: در تعدادی از گونه‌های گیاهی ، جوانه زنی در شرایط خارج آزمایشگاه ، مطلقا امکان‌پذیر نیست. در این مورد استفاده از کشت جنین ، ضروری است.
کوتاه کردن دوره اصلاح نبات: در تعدادی از گونه‌های گیاهی، خواب بذر وجود دارد که اغلب به علت پوسته بذر و یا آندوسپرم است. با حذف پوسته بذر ، جوانه‌زنی بلافاصله صورت می‌گیرد.

جلوگیری از سقط جنین در درختان هسته‌دار زود رس.
جلوگیری از سقط جنین در اثر ناسازگاری
تکثیر رویشی: مثلا در تیره گندم و راسته کاج ، از جنین به عنوان یک ماده اولیه برای تکثیر رویشی ، استفاده می‌شود.


تولید گیاهان عاری از ویروس
مبارزه با آلودگیهای داخلی که بوسیله ویروسها ، مایکوپلاسماها و قارچهای میکروسکوپی ایجاد می‌شود، بسیار مشکل می‌باشد. برخلاف آنچه که قبلا تصور می‌شد، ویروسها می‌توانند طی تکثیر جنسی نیز منتقل شوند. حداقل ۸۰ نوع از ویروسهای گیاهی می‌توانند از طریق بذر منتقل شوند. ویروسها باعث کاهش عملکرد و همچنین کاهش کیفیت تولیدات گیاهی می‌شوند.
بنابراین بسیار مهم است که مواد اولیه‌ای که برای تکثیر رویشی استفاده می‌شوند، عاری از ویروس باشند. پنج روش برای تولید گیاهان عاری از ویروس وجود دارد. استفاده از گرما ، کشت مریستم ، استفاده از گرما و سپس کشت مریستم ، تشکیل اندام هوایی نابجا و سپس کشت مریستم و پیوند مریستم روی پایه‌های عاری از ویروس که به آن ریز پیوندی نیز گفته می‌شود.

تولید گیاهان عاری از باکتری و قارچ بوسیله کشت مریستم

​

به نظر می‌رسد که تولید گیاهان عاری از باکتری و قارچ نیز بوسیله کشت مریستم امکان‌پذیر است. مهمترین جنسهای باکتری که بایستی حذف شوند، عبارتند از: Erwinia ، Pseudomonas و Bacillus و مهمترین جنس قارچها عبارتند از: Fusarium ، verticillium و Rhizoctonia. گاهی اوقات برای تعیین این که آیا گیاه عاری از باکتری یا قارچ است، یک محیط کشت غنی ، بکار می‌رود. اولین تحقیق از کشت مریستم میخک برای تولید گیاهان عاری از قارچ انجام گرفت. کشت مریستم بطور موفقیت آمیزی برای حذف باکتری Xanthomonas در گیاه بگونیا ، صورت گرفته است.

دست ورزی ژنتیکی

تا سال ۱۹۷۰ انتقال مواد ژنتیکی از یک موجود به موجود دیگر در گیاهان عالی فقط از طریق جنسی بوسیله استخراج سلول تخمزا با هسته زایشی دانه گرده امکان داشت که حاصل آن تخم بارور بود که می‌توانست از آن موجودی با خصوصیات پدری و مادری بوجود آید. انتقال مواد ژنتیکی به صورت غیر جنسی ، فقط از طریق استفاده از پروتوپلاست ، امکان‌پذیر است. دست ورزی ژنتیکی یک روش ژنتیک مولکولی انتقال مواد ژنتیکی از سلول (پروتوپلاست) دیگر در شرایط آزمایشگاهی بدون توجه به مرحله زایشی می‌باشد. انواع روشهای دست ورزی ژنتیکی شامل دو رگه‌گیری سوماتیکی ، دو رگه سیتوپلاسمی ، جذب و جابجایی هسته‌های ایزوله شده و کروموزومها و انتقال ژنتیکی.

بیوسنتز مواد در آزمایشگاه

مدت زمان طولانی است که در صنعت از کشت میکروارگانیسمها مثل پنی‌سیلیوم و استرپتوماسیس برای بدست آوردن موادی مانند پنی‌سیلین و استرپتومایسین که از نظر داروسازی مهم هستند، استفاده می‌شود. آنچه که متداول است، کاشت گیاهان دارویی و سپس استخراج ترکیبات فعال از آنهاست. این روش تولید با مشکلاتی روبه رو است که لازم است راههای دیگری بوجود آید. بدون شک بیوسنتز ترکیبات در روش آزمایشگاه (invitro) دارای مزایای زیادی است با این وجود هنوز مشکلات زیادی در این ارتباط وجود دارد.

​

چشم انداز

کاشت بافتهای گیاهی در آزمایشگاه ، ابزار مناسبی برای رسیدن به هدفهای ناممکن است که در شرایط خارج آزمایشگاه وجود دارد. نتایج کشت در آزمایشگاه دارای اهمیت زیادی در کشاورزی ، باغبانی و جنگلداری است. علاوه بر کاربرد عملی این تکنیک ، کشت سلول گیاهی ، بافت و اندام ، نقش زیادی را در بهبود آگاهی ما در رابطه با علم سلولی _ تکوینی گیاهی داشته است. در حال حاضر کشت سلول ، دارای اهمیتی خاص در بیوتکنولوژی است و متخصصین در حال تلاش جهت رشد سلول گیاهی به منظور بدست آوردن فرآورده‌های صنعتی از متابولیتهای ثانویه هستند.

منبع: urmiabreeder.ir/?p=197

 

[sepanta khazaei]

سلام با تشکر فایل رو دانلود کردم اما برای خارج شدن از حالت زیپ رمز می خواد لطفا راهنمایی بفرمایید