از فلوسایتومتری می توان برای شناسایی ذرات یا سلولها و بررسی خصوصیات آنها از جمله اندازه وگرانولاریتی ، آنالیز مارکرهای سطحی و یا داخل سلولی به منظور شناسایی، بررسی و یا جداسازی سلولهادر یک جمعیت سلولی هتروژن، بررسی عملکرد و یا بررسی چرخه سلولی، تکثیر سلولی، و یا غلظتیونهای داخل سلولی استفاده ، DNA سیگنالینک داخل سلولی، آنالیز کرد. از این رو استفاده از فلوسایتومترییکی از متداولترین تکنیکها برای شناسایی و تمایز سلولهای مختلف در بافتهای گوناگون بوده و در هماتولوژی، ایمونولوژی ، بیولوژی سرطان و انکولوژی بالینی، توکسیکولوژی، فارماکولوژی و نیز حتی گیاه شناسی ومیکروبیولوژی کاربرد دارد. در آزمایشگاههای تشخیصی، از فلوسایتومتری برای تشخیص بیماری ها، تعیینپیش آگهی و نیز ارزیابی درمان و یا عود بدخیمی ها استفاده می شود.فلوسیتومتری اجازه تجزیه و تحلیل هزار ذره را در هر ثانیه از نظر چندین پارامتر فیزیک و یا شیمیایی رامی دهد . این روش به طور معمول برای شناسایی ناهنجاری سلامتی به ویژه سرطان خون استفاده می شوداما این تکنیک استفاده گسترده دیگری هم در زمینه پژوهش و بالینی دارد . ویژگی مشترک ها این است کهذرات را بر اساس خاصیت فیزیکی آنها دسته بندی می کنند و بدین صورت میتوانیم به جمعیت خالص خوددست یابیم.
کاربرد فلوسیتومتری
پارامترهای مختلفی را می توان بوسیله تکنیک فلوسایتومتری بررسی و اندازه گیری کرد؛ از جمله: بررسیاندازه و پیچیدگیهای داخل سلولی، پیگمانهای سلولی از جمله کلروفیل، محتوای دی ان ای سلولی(برای آنالیزسیکل سلولی، کینتیک و تکثیر سلولی و یا آنالیز کروموزومها) وبیان پروتئینهای سطحی و مارکرهای سطحسلولی ( CD مارکرها)، تغییرات پروتئینی و فسفو پروتئینها، محصولات ترانس زنیک بویژه GFP یاپروتئینهای فلورسانس دیگر، پروتئینهای داخل سلولی و...از این رو فلوسایتومتری کاربردهای فراوانی در
علوم مختلف ازجمله بیولوژی ملکولی، پاتولوژی، ایمونولوژی، بیولوژی گیاهی و بیولوژی دریایی، ونیز درپزشکی (بویژه در ایمونولوژی پیوند، هماتولوژی،ایمونولوژی و شیمی درمانی سرطان و تشخیص بیماریها)دارد و توسط محققانی که در این زمینه ها کار می کنند استفاده می شود.
اصل فلوسیتومتری
باریکه ای از نور(معمولا نور لیزر) تنها از یک طول موج به جریان مایع هیدرودینامیکی فوکس شده تاباندهمی شود . تعدادی آشکارسازدر نقاطی که جریان از برابر باریکه نور عبور می کند تعبیه شده اند : یکی از آنهادر یک خط با پرتو نور (اسکاتر فوروارد یا پیش برنده FSC) و تعدادی دیگرهم عمود بر آن (اسکاتر کناریssc) قرار دارند همچنین تعدادی آشکار ساز فلورسنت هم در دستگاه تعبیه شده است . هر یک از ذرات معلقاز 0.2 تا 150 میکرومتر از برابر پرتو لیزر عبور می کنند و نور را پراکنده می کنند و مواد شیمیاییفلورسنت در ذرات و یا متصل شده به ذرات تهیج میشوند و نوری با طول موج بالا نسبت به منبع ساطعمی کنند ترکیب نور اسکترها و فلورسنت توسط دکتورها انجام میگرید این روش بررسی ساختمان فیزیکی وشیمیایی و همچنین کسب اطلاعات مختلف از هر گونه ذره را ممکنمی سازد . FSC یا اسکاتر مقابل(فوروارد اسکتر) با اندازه سلول و SSC با پیچیدگی درونی ذره (مانند شکل هسته ، تعداد و شکل گرانولهایداخل سیتوپلاسمی ، زبری غشا ) متناسب است . برخی از دستگاه های فلوسیتومتری در بازار نور فلورسنترا حذف کرده اند و تنها از نور اسکاتر ها استفاده می کنند .
فلوسیتومتر
فلوسیتومترهای امروزی قادرند تا هزار ذره را در یک ثانیه بررسی کنند که به انها "Real time" میگویند .این دستگاه ها میتوانند ذرات را بر اساس ویژگی های خاص ایزوله و آنالیز کنند . یک دستگاه فلوسیتومتریشبیه میکروسکوپ است به این تفاوت که به جای تولید یک تصویر از سلول ، دارای توانایی عملکردی بسیاربالا است و خودکار بر اساس پارامتر ها سلول ها را شمارش می کند . برای تجزیه و تحلیل بافت جامد بایدسوسپانسیونی تک سلولی از بافت تهیه کنیم .دستگاه فلوسیتومتری دارای 5 جزء اصلی است :
جریان سلولی (flow cell) : جریان مایع (مایع شیث)، که سلول های نمونه را حمل و صف بندی می کند تایکی یکی از مقابل پرتو نور لیزر عبور کنند .سیستم اندازه گیری : به طور معمول برای اندازه گیر امپدانس مورد استفاده قرار می گیرد .سیستم نوری : لامپ (جیوه یا زنون) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت زیاد (لیزری که توسط سیستم ابی خنکمی شوند) (آرگون ، کریپتون ، لیزر رنگی) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت کم (آرگون 488 نانومتر)، لیزرقرمزHeNe (633 نانومتر) ، سبز HeNe، لیزر HeCd (اشعه ماورای بنفش UV) ، لیزر دیودی (آبی ،سبز، قرمز ، بنفش) جز سیستم نوری فلوسیتومترهستند که در سیگنال نوری تکنیک کاربرد دارند .سیستم ADC (تبدیل کننده سیستم آنالوگ به دیجیتال) :که سیگنال های نوری اسکترهای جلو و پهلویی وهمچنین سیگنال های فلورسنت را به سیگنال های الکترونیکی که قابل شناسایی با کامپیوتر هستند ، تبدیلمیکند .
سیستم تقویت کننده خطی یا لگاریتمی
رایانه برای آنالیز سیگنال ها
فرایند جمع آوری اطلاعات از نمونه در دستگاه فلوسیتومتر به مرحله "'Acquisition'" یا تحصیل معروفاست . فرایند تحصیل به کمک رایانه ای انجام می گیرد که به طور فیزیکی به دستگاه وصل شده است و نرمافزاری که واسطه دیجیتالی بین کامپیوتر و کاربر است . این نرم افزار قابلیت تنظیم پارامترها بر اساس نوعنمونه را دارد (مانند ولتاژ ) . همچنین نرم افزار کمک می کند تا به اطلاعات اولیهنمونه دسترسی داشته باشیمو بدین وسیله از صحت تنظیم پارامترها اطلاع یابیم . دستگاه های فلوسیتومتری اولیه به طور کلی ،دستگاههای تجربی بودند اما پیشرفت های تکنیکی برنامه های کابردی وسیعی را ایجاد کرده است که در هردو زمینه بالینی و پژوهشی به طور گسترده استفاده می شود . با توجه به این تحولات،بازار ابزارت ، نرمافزارهای تجزیه و تحلیل وهمچنین ریجنت ها (معرف ها) مانند آنتی بادی های فلورسنت شده به طور چشم گیری گسترش یافته است .
آنالیز اطلاعات/ Gating
اطلاعات جمع اوری شده توسط فلوسیتومتر را میتوان در بُعد واحدی و یا در دو بعد و یا حتی سه بعد برایتولید یک هیستوگرام رسم نمود . مناطقی از این هیستوگرام را میتوان به صورت مرتب بر اساس شدتفلورسنت از هم جدا کرد . این کار با استفاده از "واحد های استخراجی" انجام میگیرد که به آنها "گیت"می گیوند . پروتکل های اختصاصی Gatting برای شناسایی بیماری ها و همچنین اهداف کلینیک وآزمایشگاهی به خصوص در خون شناسی تعریف و ایجاد شده است .
رسم ها معمولا در مقیاس های لگارتیمی ساخته می شوند. از انجا که طیف رنگ های فلورسنت با هم ،همپوشانی دارند سیگنال ها در دتکتورها (آشکارسازها) باید از نظر الکتریکی و محاسباتی جدا شوند .داده های گردآوری شده با فلوسیتومتری توسط نرم افزار های مختلفی مانند WinMD (توصیه نمی شود) ،Flowjo ، Cell quest Pro بررسی می شوند . بعد از اینکه داده ها جمع آوری شدنددیگر نیاز به اتصالدستگاه فلوسیتومتری نیست . به همین دلیل است که بررسی ها معمولا در رایانه جداگانه ای انجام میگیرد . اینکار به ویژه در مراکزی که با تقاضای بالا استفاده از دستگاه روبه رو هستند لازم است .Analysis of a marine sample of photosynthetic picoplankton by flow cytometry showing threedifferent populations (Prochlorococcus, Synechococcus, and picoeukaryotes)تجزیه و تحلیل محاسباتی | Computational analysisپیشرفت های اخیر در شناسایی خودکار که بر اساس روشهای محاسباتی انجام میگرید ارئه کننده جایگزینیبرای استراژی های gate است . سیستم های خودکار شناسایی به طور بالقوه جمعیت های پنهان و نادر راشناسایی می کنند
تهیه کننده : سرکار خانم فاطمه نیک خواه
کاربرد فلوسیتومتری
پارامترهای مختلفی را می توان بوسیله تکنیک فلوسایتومتری بررسی و اندازه گیری کرد؛ از جمله: بررسیاندازه و پیچیدگیهای داخل سلولی، پیگمانهای سلولی از جمله کلروفیل، محتوای دی ان ای سلولی(برای آنالیزسیکل سلولی، کینتیک و تکثیر سلولی و یا آنالیز کروموزومها) وبیان پروتئینهای سطحی و مارکرهای سطحسلولی ( CD مارکرها)، تغییرات پروتئینی و فسفو پروتئینها، محصولات ترانس زنیک بویژه GFP یاپروتئینهای فلورسانس دیگر، پروتئینهای داخل سلولی و...از این رو فلوسایتومتری کاربردهای فراوانی در
علوم مختلف ازجمله بیولوژی ملکولی، پاتولوژی، ایمونولوژی، بیولوژی گیاهی و بیولوژی دریایی، ونیز درپزشکی (بویژه در ایمونولوژی پیوند، هماتولوژی،ایمونولوژی و شیمی درمانی سرطان و تشخیص بیماریها)دارد و توسط محققانی که در این زمینه ها کار می کنند استفاده می شود.
اصل فلوسیتومتری
باریکه ای از نور(معمولا نور لیزر) تنها از یک طول موج به جریان مایع هیدرودینامیکی فوکس شده تاباندهمی شود . تعدادی آشکارسازدر نقاطی که جریان از برابر باریکه نور عبور می کند تعبیه شده اند : یکی از آنهادر یک خط با پرتو نور (اسکاتر فوروارد یا پیش برنده FSC) و تعدادی دیگرهم عمود بر آن (اسکاتر کناریssc) قرار دارند همچنین تعدادی آشکار ساز فلورسنت هم در دستگاه تعبیه شده است . هر یک از ذرات معلقاز 0.2 تا 150 میکرومتر از برابر پرتو لیزر عبور می کنند و نور را پراکنده می کنند و مواد شیمیاییفلورسنت در ذرات و یا متصل شده به ذرات تهیج میشوند و نوری با طول موج بالا نسبت به منبع ساطعمی کنند ترکیب نور اسکترها و فلورسنت توسط دکتورها انجام میگرید این روش بررسی ساختمان فیزیکی وشیمیایی و همچنین کسب اطلاعات مختلف از هر گونه ذره را ممکنمی سازد . FSC یا اسکاتر مقابل(فوروارد اسکتر) با اندازه سلول و SSC با پیچیدگی درونی ذره (مانند شکل هسته ، تعداد و شکل گرانولهایداخل سیتوپلاسمی ، زبری غشا ) متناسب است . برخی از دستگاه های فلوسیتومتری در بازار نور فلورسنترا حذف کرده اند و تنها از نور اسکاتر ها استفاده می کنند .
فلوسیتومتر
فلوسیتومترهای امروزی قادرند تا هزار ذره را در یک ثانیه بررسی کنند که به انها "Real time" میگویند .این دستگاه ها میتوانند ذرات را بر اساس ویژگی های خاص ایزوله و آنالیز کنند . یک دستگاه فلوسیتومتریشبیه میکروسکوپ است به این تفاوت که به جای تولید یک تصویر از سلول ، دارای توانایی عملکردی بسیاربالا است و خودکار بر اساس پارامتر ها سلول ها را شمارش می کند . برای تجزیه و تحلیل بافت جامد بایدسوسپانسیونی تک سلولی از بافت تهیه کنیم .دستگاه فلوسیتومتری دارای 5 جزء اصلی است :
جریان سلولی (flow cell) : جریان مایع (مایع شیث)، که سلول های نمونه را حمل و صف بندی می کند تایکی یکی از مقابل پرتو نور لیزر عبور کنند .سیستم اندازه گیری : به طور معمول برای اندازه گیر امپدانس مورد استفاده قرار می گیرد .سیستم نوری : لامپ (جیوه یا زنون) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت زیاد (لیزری که توسط سیستم ابی خنکمی شوند) (آرگون ، کریپتون ، لیزر رنگی) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت کم (آرگون 488 نانومتر)، لیزرقرمزHeNe (633 نانومتر) ، سبز HeNe، لیزر HeCd (اشعه ماورای بنفش UV) ، لیزر دیودی (آبی ،سبز، قرمز ، بنفش) جز سیستم نوری فلوسیتومترهستند که در سیگنال نوری تکنیک کاربرد دارند .سیستم ADC (تبدیل کننده سیستم آنالوگ به دیجیتال) :که سیگنال های نوری اسکترهای جلو و پهلویی وهمچنین سیگنال های فلورسنت را به سیگنال های الکترونیکی که قابل شناسایی با کامپیوتر هستند ، تبدیلمیکند .
سیستم تقویت کننده خطی یا لگاریتمی
رایانه برای آنالیز سیگنال ها
فرایند جمع آوری اطلاعات از نمونه در دستگاه فلوسیتومتر به مرحله "'Acquisition'" یا تحصیل معروفاست . فرایند تحصیل به کمک رایانه ای انجام می گیرد که به طور فیزیکی به دستگاه وصل شده است و نرمافزاری که واسطه دیجیتالی بین کامپیوتر و کاربر است . این نرم افزار قابلیت تنظیم پارامترها بر اساس نوعنمونه را دارد (مانند ولتاژ ) . همچنین نرم افزار کمک می کند تا به اطلاعات اولیهنمونه دسترسی داشته باشیمو بدین وسیله از صحت تنظیم پارامترها اطلاع یابیم . دستگاه های فلوسیتومتری اولیه به طور کلی ،دستگاههای تجربی بودند اما پیشرفت های تکنیکی برنامه های کابردی وسیعی را ایجاد کرده است که در هردو زمینه بالینی و پژوهشی به طور گسترده استفاده می شود . با توجه به این تحولات،بازار ابزارت ، نرمافزارهای تجزیه و تحلیل وهمچنین ریجنت ها (معرف ها) مانند آنتی بادی های فلورسنت شده به طور چشم گیری گسترش یافته است .
آنالیز اطلاعات/ Gating
اطلاعات جمع اوری شده توسط فلوسیتومتر را میتوان در بُعد واحدی و یا در دو بعد و یا حتی سه بعد برایتولید یک هیستوگرام رسم نمود . مناطقی از این هیستوگرام را میتوان به صورت مرتب بر اساس شدتفلورسنت از هم جدا کرد . این کار با استفاده از "واحد های استخراجی" انجام میگیرد که به آنها "گیت"می گیوند . پروتکل های اختصاصی Gatting برای شناسایی بیماری ها و همچنین اهداف کلینیک وآزمایشگاهی به خصوص در خون شناسی تعریف و ایجاد شده است .
رسم ها معمولا در مقیاس های لگارتیمی ساخته می شوند. از انجا که طیف رنگ های فلورسنت با هم ،همپوشانی دارند سیگنال ها در دتکتورها (آشکارسازها) باید از نظر الکتریکی و محاسباتی جدا شوند .داده های گردآوری شده با فلوسیتومتری توسط نرم افزار های مختلفی مانند WinMD (توصیه نمی شود) ،Flowjo ، Cell quest Pro بررسی می شوند . بعد از اینکه داده ها جمع آوری شدنددیگر نیاز به اتصالدستگاه فلوسیتومتری نیست . به همین دلیل است که بررسی ها معمولا در رایانه جداگانه ای انجام میگیرد . اینکار به ویژه در مراکزی که با تقاضای بالا استفاده از دستگاه روبه رو هستند لازم است .Analysis of a marine sample of photosynthetic picoplankton by flow cytometry showing threedifferent populations (Prochlorococcus, Synechococcus, and picoeukaryotes)تجزیه و تحلیل محاسباتی | Computational analysisپیشرفت های اخیر در شناسایی خودکار که بر اساس روشهای محاسباتی انجام میگرید ارئه کننده جایگزینیبرای استراژی های gate است . سیستم های خودکار شناسایی به طور بالقوه جمعیت های پنهان و نادر راشناسایی می کنند
تهیه کننده : سرکار خانم فاطمه نیک خواه