سیستم بیان pET

[z.kouchack]

[FONT=&quot]سیستم بیان [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] یکی از پر کاربردترین سیستم های ناقل مورد استفاده برای کلونینگ ژن های خارجی و بیان پروتئین های آنها در باکتری [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] است. قطعه [/FONT][FONT=&quot]DNA[/FONT][FONT=&quot] حامل ژن مورد نظر در پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] در پایین دست سیگنال های نسخه برداری و ترجمه قوی که از باکتریوفاژ [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] منشأ گرفته اند، قرار داده می شود. هر گاه پلاسمید نوترکیب حاصل به یک سویه باکتری [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] وارد شود که آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز فاژ [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] در آن حضور داشته باشد، نسخه برداری و ترجمه ژن کلون شده با کارایی بسیار بالایی انجام می شود. برای آنکه ژن کلون شده در پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] بیان شود، نیاز به حضور آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز باکتریوفاژ [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] در باکتری میزبان است. آنزیم مزبور در باکتری میزبان ممکن است از طریق آلوده کردن باکتری حامل پلاسمید با فاژ [/FONT][FONT=&quot]λ CE6[/FONT][FONT=&quot] تولید شود. ژنوم این فاژ پس از ورود به باکتری، آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] را تولید می نماید. آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز مزبور توالی پروموتور [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] را بر روی پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] شناسایی نموده و با سرعت نسخه برداری از ژن کلون شده در پایین دست پروموتور را شروع و ادامه می دهد. در فاصله بین پروموتور [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] و ژن کلون شده بر روی پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] یک سیگنال ترجمه مربوط به ژن [/FONT][FONT=&quot]10[/FONT][FONT=&quot] فاژ قرار داده شده است که این سیگنال امکان ترجمه فراوان نسخه [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] را فراهم می نماید. بعضی سویه های باکتری به نحوی مهندسی شده اند که ژن کد کننده [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز [/FONT][FONT=&quot]T7[/FONT][FONT=&quot] تحت پروموتور القایی [/FONT][FONT=&quot]lacUV5[/FONT][FONT=&quot] در کروموزوم آنها جاسازی شده است. این باکتریها پس از دریافت پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] حامل ژن مورد نظر، برای تولید [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز به آلودگی فاژی نیاز ندارند. باکتری حامل پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] نوترکیب به محیط کشت حاوی [/FONT][FONT=&quot]IPTG[/FONT][FONT=&quot] منتقل می گردد. بیان پروموتور [/FONT][FONT=&quot]lacUV5[/FONT][FONT=&quot] در اثر [/FONT][FONT=&quot]IPTG[/FONT][FONT=&quot] القا شده و آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز لازم برای نسخه برداری تولید می شود. پلاسمیدهای [/FONT][FONT=&quot]pET[/FONT][FONT=&quot] از پلاسمید [/FONT][FONT=&quot]Pbr322[/FONT][FONT=&quot] مشتق شده اند و حامل ژن نشانگر مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین یا کانامایسین می باشند.[/FONT]