روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت)

sey

عضو جدید
انتقال صفات با ارزش به گیاهان زراعی از گذشته های دور با استفاده از روشهای کلاسیک (عمدتا دورگ گیری)، صورت می گرفت. در این روشها محدودیت منبع ژن، بازدارنده اصلی توفیق در برنامه های اصلاحی است. مفهوم این عبارت این است که برای انتقال یک ژن با ارزش باید آن ژن در منبع ژن آن گونه خاص ویا حداکثر گونه های نزدیک قابل تلاقی با گونه مدنظر موجود باشد. در صورتی که این صفت در گونه ای دور از خانواده یا راسته ای متفاوت یافت شود اصلاح نباتات سنتی نمی تواند کاری از پیش ببرد. مهندسی ژنتیک و روش های مختلف انتقال ژن، امکان انتقال ژنهای مورد نظر را از هر موجودی به موجود دیگر فراهم کرده است. روش های انتقال ژن در گیاهان شامل موارد زیر می باشند: 1- انتقال غیر مستقیم: 1-1- انتقال ژن از طریق اگروباکتریوم 2- انتقال مستقیم: 2-1- انتقال ژن بروش بمباران ذره ای 2-2- الکتروپوریشن 2-3- ریز تزریقی و درشت تزریقی 2-4- تراریختی از طریق لیپوزوم 2-5- انتقال ژن با استفاده از پلی کاتیون ها 1- انتقال غیر مستقیم 1-1- انتقال ژن از طریق آگروباکتریوم در سال 1907 گزارش Smith و Townsendمبتنی بر این که عامل ایجاد بیماری گال طوقه (Crown Gall) یک باکتری گرم منفی هوازی و میله ای شکل به نام آگروباکتریوم تومفاسینس (Agrobacterium tumefaciens) است، انتشار یافت. این پاتوژن بطور عمده از طریق زخمهای ایجاد شده بر روی اندامهای زیر زمینی و طوقه، وارد گیاه شده و از طریق القای رشد بی رویه در سلولهای این منطقه ایجاد بیماری گال طوقه می نماید. بعدها در سال 1974 مطالعات Zaenen و همکارانش نشان داد که ژنهای موجود بر روی یک قطعه DNA خارج کروموزومی باکتری بطول بیش ازKbp ع200 عامل ایجاد آلودگی در گیاه می باشد. این قطعه در واقع شامل پلاسمیدی بود که در سال 1975 توسط Van Larebecke و همکاران بعنوان پلاسمید القاء کننده تومور(Tumor inducing Plasmid) یا پلاسمید Ti نام گرفت. از این زمان باکتری آگروباکتریوم بخاطر قابلیت انتقال قطعه ای از پلاسمید خود به نام انتقالی (Transfer DNA) یا T-DNA به درون سلول میزبان و ابراز طبیعی آن به همراه ژن های میزبان مورد توجه ویژه ای قرار گرفت. طول قطعات T-DNA بسته به اینکه از چه سویه هایی از باکتری منشا گرفته باشند از 12 تا 24 کیلو جفت باز متغیر است. T-DNA دارای دو گروه از ژنها می باشد، گروه اول که به نام ژنهای انکوژن شناخته می شوند، قادر به تولید آنزیمهایی هستند که در ساخت سیتوکینین و اکسین دخالت داشته و عملا تولید تومور می کنند. گروه دوم ژنهایی هستند که مواد خاصی به نام اپاین می سازند که توسط باکتری بعنوان منبع کربن و نیتروژن مورد استفاده قرار می گیرند. تقسیم بندی پلاسمید Tiبر مبنای اپاین هایی است که تولید می نماید و بر همین مبنا، پلاسمیدهای نوپالینی، اکتوپینی، اگروپینی و مانوپینی شناسایی شده اند. سویه هایی از باکتری آگروباکتریوم که فاقد پلاسمید Tiمی باشند دارای خاصیت گال زایی در گیاه نمی باشند. اولین مرحله در انتقال T-DNA به گیاه، جذب باکتری بروی زخم های موجود بر روی سلولهای ناحیه ابتدایی ساقه و طوقه گیاه می باشد. در واقع تصور می شود که زخم های ایجاد شده موانع فیزیکی موجود بر سر راه انتقال باکتری بدرون گیاه را مرتفع ساخته و از این طریق انتقال T-DNA را تسهیل می بخشند. امروزه ثابت شده است که عکس العمل باکتری ها غالبا در اثر وجود بعضی از مواد فنولیک همانند Acetosyringone و Hydroxyacetosyringone در محیط است که از بافت های مجروح ترشح می شوند. این مواد در حقیقت قسمتی از محصولات متابولیسم فنیل پروپانویید در گیاه به شمار می آیند که چرخه اصلی ساخت متابولیت های ثانویه از قبیل لیگنین و فلاونوئیدها را شامل می شود. ترکیبات فنولیک مذکور در واقع بعنوان محرک فعالیت برخی از ژنهای موجود بر روی پلاسمید Tiعمل کرده که نقش مهمی را در مراحل انتقال T-DNA به گیاه برعهده دارند. این گروه از ژنها به نام ژنهای بیماریزا (Virulence Genes) و یا ژنهای Vir نامیده می شوند. ژنهای بیماری زا، بر روی ناحیه ای از پلاسمید Ti بطول 35 کیلو جفت باز استقرار یافته اند. محصولات ژنهای بیماریزا برای انتقال و جایگزینی قطعه T-DNA بدرون ژنوم گیاه ضروری هستند. لازم به ذکر است که جهت القای خاصیت تراریختی، قطعه T-DNA و ژنهای بیماری زا ملزم به استقرار بر روی یک پلاسمیدTi واحد نمی باشند. این بدان معنی است که اگر یک باکتری حاوی پلاسمید و ژنهای بیماری زا و باکتری دیگر حاوی قطعه T-DNA و ژن مورد نظر باشد، قادر خواهند بود فرآیند انتقال T-DNA را بدرون ژنوم گیاه با موفقیت به ثمر برسانند(ناقل های دوگانه). اولین مورد تراریختی گیاهان توسط Herrera-Estrella در سال 1983 در گیاه تنباکو گزارش گردید. اگرچه آگروباکتریوم بطور طبیعی تنها گیاهان دولپه را آلوده می سازد، اما با درک عمیق مکانیسم انتقال ژن به گیاهان، انتقال ژن به گیاهان تک لپه با استفاده از اگروباکتریوم نیزمیسر گردید، در حال حاضر برنج، موز، گندم، ذرت و نیشکر از گیاهان تک لپه بخوبی تراریخت و باززائی می شوند. مزایا و معایب روش آگروباکتریوم- مزایا: جوابدهی بسیار بالا برای گیاهان دولپه و بخصوص خانوده سولاناسه، انتقال با کیفیت بالا، تعداد پایین کپی نامبر ژن (تعداد زیاد کپی نامبر ژن، سبب تداخل اثر ژنها می گردد)، دست نخوردگی قطعات ژن (عدم شکستگی، موتاسون کمتر). معایب: بسیار وابسته به کشت این ویترو است و برای هر گونه گیاهی باید از متود ویژه ای برای کشت این ویترو استفاده کرد. ژنوتیپها تحت تاثیر تغییرات سوماکلونال می باشند. مطالعه پستهای 1 و 2 جهت آشنایی بیشتر با ساختار ژنومی آگروباکتریوم وچگونگی انتقال ژن از طریق آن توصیه می شود.

2- انتقال مستقیم: توسعه و تکامل ناقلین ژنی در گیاهان غالبا بر اساس انتقال DNA از طریق میزبانهای واسطه باکتریایی صورت گرفته است. در مواردی که انتقال DNAخارجی از این طریق امکان پذیر نیست، روشهای انتقال مستقیم، بر اساس نوع هدف و خصوصیات بافت مورد نظر بکار برده می شوند. در واقع تراریختی مستقیم روشی است که در آن سلولهای میزبان بدون کمک میزبان واسطه DNA خارجی را دریافت می کنند. دانشمندان علم بیولوژی مولکولی گیاهی امروزه در فکر بکار بستن روشهای نوین در انتقال ژن به غلات هستند. غلات، بعنوان عمده ترین محصولات زراعی، حساسیت کمتری نسبت به آلودگی از طریق آگروباکتریوم و انتقال DNA از خود نشان می دهند و بنابراین محققین عمدتا از روش بمباران ذره ای برای انتقال ژن به خانواده گرامینه استفاده می کنند. در تراریختی مستقیم، DNA خارجی از طریق تکنیک های مختلف فیزیکی بدرون پروتوپلاست سلولی انتقال می یابد. در ادامه به شرح مختصری در مورد روشهای متداول انتقال مستقیم ژن می پردازیم. 2-1- انتقال ژن بروش بمباران ذره ای انتقال ژن بروش بمباران ذره ای اولین بار توسط Sanford و همکاران در سال 1987 گزارش شد که در منابع مختلف به نامهای تفنگ ژنی و روش زیست پرتابی نیز مورد اشاره قرار گرفته است. در این روش اسید نوکلئیک بر روی ذراتی از جنس تنگستن و یا طلا به قطر 5 تا نیم میکرون قرار داده شده و با سرعت زیاد (معادل سیصد تا ششصد متر بر ثانیه) توسط گاز هلیوم بداخل بافت های سالم فرستاده می شود. ذرات ناقل ((Microcarriers پس از قرار گرفتن بر روی یک غشا ناقل (Macrocarriers) با فشار در داخل محفظه تفنگ ژنی پرتاب شده و پس از برخورد با صفحه ای به نام صفحه متوقف کننده (از جنس یک توری فلزی)، بداخل بافت مورد نظر نفوذ می یابند. در چنین شرایطی این ذرات قابلیت نفوذ بدرون غشا سلولی بدون آسیب رساندن به آن را دارا می باشند. انتقال ژن از طریق بمباران ذره ای یکی از مناسب ترین روشهای انتقال مستقیم DNA در سولهای گیاهی، جانوری، باکتریایی و نیز در سطح اندامک های سلولی می باشد. عوامل موثر در انتقال DNAبروش بمباران ذره ای را می توان در سه گروه خصوصیات مربوط به ذرات حامل، شتاب دهنده (Particle accelerator) و نمونه مورد آزمایش خلاصه نمود. عوامل مربوط به ذرات حامل شامل اندازه، مقدار و نوع ذرات حامل و در مورد شتاب دهنده شامل فشار گاز بکاررفته، فاصله مابین غشاحامل و صفحه پاره شونده (Rupture Disk)، فاصله بین غشا حامل و صفحه متوقف کننده (مسافت سیر غشا حامل) و در نهایت فاصله مابین نمونه با صفحه متوقف کننده (مسافت هدف) می باشد. در این روش با افزایش غلظت DNA تا حد معینی می توان فراوانی سلولهای تراریخت را افزایش داد. از آنجایی که سلولهای انتقال یافته بطور موقت و ناپایدار باعث بیان ژن خارجی می شوند، از این روش در مطالعات مربوط به ابراز ناپایدار ژن Transient gene expressionاستفاده می شود. در واقع مادامی که DNAخارجی با ژنوم تلفیق نیافته است، تقسیم سلول های تراریخت موجب حذف تدریجی آن می شود، ولی اگرDNA وارد شده به هسته برسد و وارد ژنوم شود، تراریختی پایدار خواهیم داشت. ساختار و نوع DNA ناقل نیز در تلفیق و تظاهر ژنهای خارجی در درون میزبان بسیار موثر می باشند. بعنوان مثال راندمان تراریختی در حالتی که DNA بکار رفته از نوع خطی می باشد، به مراتب بیش از DNA حلقوی می باشد و همچنین ناقلین پلاسمیدی بزرگ (بیش از 10 کیلو باز) در مقایسه با ناقلین کوچکتر معمولا از میزان ابراز ژن کمتری بدلیل قطعه قطعه شدن DNA در هنگام بمباران ذره ای برخوردارند، به همین دلیل ناقلین مورد استفاده در روش انتقال از طریق آگروباکتریوم معمولا در این روش کاربرد نداشته و از ناقلین با ساختار بهینه سازی شده استفاده می شود. بعنوان مثال پلاسمید pBI221در واقع شامل بسته ژنی 35S-GUS- Nos از پلاسمید pBI121 بوده که جهت انتقال مستقیم، در پلاسمید pUC19 کلون شده است. مزایا و معایب روش بمباران ذره ای- مزایا: جوابدهی بسیار بالایی دارد، مثلا در آفتابگردان بدلیل سختی انتقال ژن، فقط روش بمباران ذره ای موثربوده است. معایب: وابستگی به کشت این ویترو، امکان دست خوردگی قطعات ژنی، پایین بودن دقت کار (ممکن است ژن وارد هسته نشود ویا حتی از سلول گیاه عبور کند). پروتکل انجام بمباران ذره ای در برنج بطور خلاصه بدین شرح است: ذرات طلا با استفاده از پلاسمید حامل ژن بتا گلوکورونیداز (GUS)، توالی ژنی هدف و ژن مقاومت به هیگرومایسین ب پوشش داده می شوند. کالوس های جنین زای برنج با استفاده از این ذرات بوسیله یک دستگاه تفنگ ژنی بمباران می شوند و پس از یک تا 2 روز، فعالیت ژن بتاگلوکورونیداز با استفاده از رنگ آمیزی بافت کالوس به کمک سوبسترایی که در حضور آنزیم حاصل از فعالیت این ژن ایجاد رنگ آبی می کند (سوبسترای 5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل بتا دی گلوکورونید)، مورد مطالعه قرار می گیرد. گروه 5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل در اثر هیدرولیز توسط آنزیم و مولکول اکسیژن، دایمری را تشکیل می دهد که همان رسوب آبی رنگ می باشد که بصورت نقاط یا لکه هایی در کالوسها قابل مشاهده می باشند. کالوس های تراریخته (دارای لکه های آبی رنگ) را به محیط کشت مخصوص القای کالوس (حاوی هیگرومایسین ب) منتقل می کرده و بمدت 15 روز در اتاق تاریک قرار می دهند. کالوس هایی که در این محیط کشت زنده مانده و رشد فعالی نشان می دهند (در این آزمایش، از ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین بعنوان ژن نشانگر استفاده شده است) را به محیط کشت مخصوص باززایی منتقل کرده و در اتاق روشن قرار می دهند. هر دو هفته یکبار کالوسها را به محیط کشت تازه مخصوص باززایی منتقل می نمایند تا تولید گیاهچه نمایند. پس از رشد گیاهچه ها، باید آنها را به محیط کشت مخصوص ریشه زایی منتقل و پس از ریشه زایی، گیاهچه ها را به محیط کشت مایع یوشیدا منتقل می کنند. پس از 10 تا 15 روز گیاهچه ها را درگلدانهای حاوی خاک به گلخانه می برند. پس از این مرحله، جهت اطمینان از قرار گرفتن ژن در محل هدف ژنوم گیاه میزبان و بیان مناسب و مطلوب آن (تعداد کپی نامبرهای انتقال یافته از ژن هدف)، آنالیزهای مولکولی لازمه چون ساترن، وسترن و الایزا و غیره انجام خواهد گرفت.
2-2
[FONT=times new roman,times,serif] الکتروپوریشن (ایجاد منافذ بوسیله الکتریسیته)[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]در روش الکتروپوریشن (Electroporation)، برای انتقال DNA، سلولها در معرض ولتاژهای بالا قرار می گیرند. در واقع در اثر شوک الکتریکی، منافذ کوچکی در سطح غشای سلولی بطور موقت ایجاد می شود که به آن خاصیت نفوذپذیری نسبت به اسید نوکلئیک می دهد. در عمل جهت تسهیل عمل جذب، DNA در تماس مستقیم با پروتوپلاست سلول قرار داده می شود. در گیاهان انتقال DNA از طریق الکتروپوریشن در توتون، اطلسی، ذرت، برنج، گندم و سورگوم گزارش شده است. در هویج، توتون و ذرت نیز ژن گزارش گر CAT (کلروم فنیکول استیل ترانسفراز) در ترکیب با راه اندازهای مختلف، از طریق این تکنیک انتقال و ابراز یافته است. این روش قابلیت کاربرد در گونه های مختلف تک لپه و دولپه را دارد.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]روش الکتروپوریشن دارای مزایای متعددی است که از آن جمله سرعت و راندمان بالا، سادگی عمل، قابلیت کاربرد در گونه های مختلف گیاهی و سمیت کم برای سلول را می توان ذکر کرد.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]در مقابل، نقاط ضعف آن شامل ضرورت استفاده از پروتوپلاست سلولی و مشکلات موجود بر سر راه باززایی و تولید کالوس از آنهاست.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]در روش های نوین، استفاده از بافت های با قابلیت باززایی بهتر از قبیل جنین های نارس مدنظر قرار گرفته است.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]2-3 ریز تزریق (Microinjection) و درشت تزریق (Macroinjection)[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]ریز تزریق درون هسته ای یکی از روشهای مستقیم انتقال ژن بوده که بسیاری از مشکلات زیستی و فیزیکی موجود در انتقال DNAرا مرتفع ساخته است. از ریز تزریقی اول بار در سلولهای جانوری استفاده شده است.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]در این روش، با استفاده از سوزنهای موئینه مناسب، DNA مورد نظر بدرون سلول میزبان (و یا هسته آن) انتقال یافته به ترتیبی که سلول هدف قابلیت تکثیر و بقاء خود را حفظ می کند.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]از مزایای این روش می توان به موارد زیر اشاره کرد: [/FONT] [FONT=times new roman,times,serif] 1- مقدار DNAتزریق شده مورد استفاده برای هر سلول قابل تنظیم بوده و تحت اثر عوامل تکنیکی دچار محدودیت نمی شود.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]2- بدلیل دقت بسیار زیاد در تزریق مستقیم DNA بدرون سلولهای منفرد و قابلیت دسترسی به هسته سلول، شانس بدست آوردن سلول های تراریخت به مراتب افزایش می یابد.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]3- با استفاده از این روش، قابلیت انتقال DNAخارجی به درون ساختارهای کوچک(شامل تعداد محدودی سلول) از قبیل جنین های هاپلویید (در مرحله چند سلولی) بدست می آید.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif] 4- بدلیل انتقال مستقیم ژن، محدودیت نوع میزبان وجود ندارد و در عین حال ضرورت استفاده از سلولهای منفرد در هر تزریق و به کار بستن تجهیزات و مهارت های خاص در این روش محدودیت هایی را بوجود می آورد.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]ریز تزریقی دارای کاربردهای ویژه ای در علوم گیاهی می باشد، در مواردی با تزریق مستقیم رنگهای حاوی فلورسنس بدرون سلول های در حال تمایز می توان به نحوه تبادل مواد بین این سلولها پرداخت. [/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]از این روش برای تزریق DNA نوترکیب بدرون سلولهای جنسی حیوانات و یا گیاهان استفاده وسیعی بعمل می آید.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]در روش درشت تزریق، با استفاده از سوزن هایی با قطر بزرگتر از قطر سلول، DNA خارجی بدرون مجموعه ای از بافت های حاوی جراحات تزریق می شود. بدین ترتیب DNA، برای ترکیب با ژنوم میزبان بایستی از طریق سلول های مجاور مناطق دارای جراحات وارد فضای درون سلولی بشود. در عمل بدلیل وجود موانع مختلف بر سر راه نفوذ DNA، بخصوص در بافت های با دیواره سلولی چند لایه (مانند دانه گرده)، تلفیق DNA خارجی بدرون سلول بسیار مشکل و به ندرت اتفاق می افتد. از این روش معمولا در انتقال سلولهای تخمک و جنین های نارس استفاده می شود.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]2-4 تراریختی از طریق لیپوزوم (Lipoinfection)[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]یکی از تکنیک هایی که در یکی دو دهه اخیر توجه زیادی را بخود جلب کرده است استفاده از لیپوزومها در انتقال ژن می باشد. لیپوزوم ها یک وزیکول غشایی مصنوعی بوده که شامل یک فسفولیپید کروی دو لایه ای می باشند. پس از پوشش یافتن لیپوزومها با اسید نوکلئیک، کمپلکس حاصله که مقاوم به فعالیت نوکلئازها بوده، با قرار گرفتن در مجاورت سلول های میزبان با آنها امتزاج می یابد. استفاده از لیپووزمها به عنوان ناقلین DNA شامل مزایای زیر است:[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]1- سمیت کم و قابلیت استفاده از گونه های گیاهی متعدد[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]2- حفاظت اسید نوکلئیک پوشش یافته در سطح لیپوزومها از فعالیت نوکلئازی آنزیم های موجود در محیط کشت[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]3- راندمان بالا در انتقال DNA بدرون پروتوپلاست سلولهای میزبان[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]در آزمایشات انجام گرفته بر روی انتقال ویروس موزائیک توتون (Tobacco Mosaic Virus)، از لیپوزمهای فسفاتیدیل سرین دارای بار الکتریکی منفی استفاده شده است.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]ناقلین بکار رفته در انتقال ژن از طریق لیپوزومها غالبا از نوع غیر Ti بوده و از این روش عموما برای انتقال میزبان های مقاوم به آگروباکتریوم استفاده بعمل می آید.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]معمولا در اثر Sonicationمخلوطی از فسفاتیدیل سرین در یک بافر آبی، وزیکول های مصنوعی یکنواخت، به قطر 0/4 میکرومتر بدست می آیند.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]2-5 انتقال ژن با استفاده از پلی کاتیون ها (Poly- Cation mediated gene transfer)[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif] یکی از روشهای انتقال DNA، استفاده از پلی کاتیو نهای آبدوست با زنجیره طویل از قبیل پلی اتیلین گلیکول (PEG)، پلی ال لایزین، پلی ال ورنتین و یا DEAE– دکستران می باشد. پلی کاتیون ها خود می توانند شامل یون های فلزی از قبیل کلسیم، سدیم، پتاسیم، روبیدیوم، سزیم، لیتیم و منیزیم [/FONT][FONT=times new roman,times,serif]باشند. این روش عملا می تواند در انتقال پروتوپلاست های سلولی گونه های مختلف و با استفاده از مقادیر بسیار کم DNA کاربرد داشته باشد. پلی اتیلن گلیکول یک ماده آبدوست قوی بوده که باعث جذب مولکول های آزاد آب در محیط می شود. بنابراین در غلظت های بالای PEG، غلظت های 15الی 25 درصد، مولکول های دارای بار الکتریکی، مانند DNA، قادر به استقرار در حالت محلول نبوده و رسوب می یابند. [/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]غشاهای سلولی و مولکولهای DNA هر دو دارای بار الکتریکی منفی بوده و این امر موجب کندی جذب DNA از طریق دافعه بارهای هم نام می شود. استفاده از پلی اتیلن گلیکول در غلظت های بالا در واقع دافعه بین این دو سطح را بحداقل رسانده و جذبDNA از طریق غشا سلولی و بدون وارد آمدن صدمات مکانیکی به پروتوپلاست را تسهیل می بخشد. پلی کاتیونها همچنین از طریق حفاظت DNA خارجی در مقابل اثرات تخریبی آنزیمهای نوکلئازی و افزایش خاصیت نفوذ پذیری غشاء سلولی، باعث تسهیل جذب DNA بدرون پروتوپلاست سلولی می شوند.[/FONT] [FONT=times new roman,times,serif]* در تهیه مطلب حاضر، عمدتا از مطلبی که تحت عنوان: روش های کلی انتقال ژن به گیاه به نویسندگی: دکتر امیر موسوی در درسنامه کارگاه نظری و عملی بیان ژن در گیاهان (اسفند 1379) صفحات 83-71 به چاپ رسیده، استفاده شده است.[/FONT]
 

z.kouchack

عضو جدید
حامل های مخصوص بیان ژن های خارجی در E. coli

حامل های مخصوص بیان ژن های خارجی در E. coli

[FONT=&quot]اگر یک ژن خارجی (غیرباکتریایی) را به درون یک حامل استاندارد وارد کرد و در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] کلون نمود، بعید است که مقدار مناسبی از پروتئین نوترکیب ساخته شود. زیرا بیان ژن بستگی به مجموعه ای از علایم اطراف ژن دارد که توسط باکتری شناسایی می شوند. این علایم توالی های نوکلئوتیدی هستند که نشان دهنده وجود ژن در آن ناحیه هستند و راهنمایی های لازم برای سیستم رونویسی و ترجمه سلول را فراهم می کنند. سه تا از مهم ترین علایمی که در ژن های [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] وجود دارند، عبارتند از:[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]پروموتور، نقطه شروع رونویسی ژن را مشخص می کند. در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot]، پروموتور توسط زیرواحد [/FONT][FONT=&quot]σ[/FONT][FONT=&quot] آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز شناسایی می شود.[/FONT] [FONT=&quot]ترمیناتور، نقطه پایان ژن، یعنی محل خاتمه رونویسی را مشخص می کند. ترمیناتور معمولاً توالی نوکلئوتیدی است که می تواند ساختار سنجاق سر ایجاد کند.[/FONT] [FONT=&quot]جایگاه اتصال ریبوزوم، توالی کوتاه نوکلئوتیدی است که توسط ریبوزوم به عنوان نقطه اتصال به [/FONT][FONT=&quot]mRNA[/FONT][FONT=&quot] شناسایی می شود. کدون شروع ژن معمولاً چند نوکلئوتید فرودست این جایگاه قرار دارد.[/FONT] [FONT=&quot]ژن های موجودات زنده عالی تر نیز دارای علایم بیان هستند که البته توالی نوکلئوتیدی آن ها با علایم [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] متفاوت است. پروموتور ژن های [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] و انسان مقایسه شده اند، هر چند تشابهاتی میان آنها وجود دارد، اما بعید است که [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] بتواند به پروموتور انسان بچسبد. ژن های خارجی در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] غیرفعال است، زیرا علایم بیان آنها توسط باکتریها قابل شناسایی نیست.[/FONT] [FONT=&quot]یک راه حل برای این مشکل، وارد کردن ژن به درون حامل هایی است که مجموعه ای از علایم بیان [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] را دارند. به این ترتیب امکان رونویسی و بیان ژن فراهم می شود. به حامل های کلون سازی که دارای این علایم هستند و می توان از آنها برای تولید پروتئین های نوترکیب استفاده کرد، حامل های بیانی می گویند.[/FONT] [FONT=&quot]پروموتور مهم ترین جزء یک حامل بیانی است. زیرا پروموتور اولین مرحله بیان ژن (اتصال آنزیم [/FONT][FONT=&quot]RNA[/FONT][FONT=&quot] پلیمراز به [/FONT][FONT=&quot]DNA[/FONT][FONT=&quot]) را کنترل کرده و سرعت ساخته شدن [/FONT][FONT=&quot]mRNA[/FONT][FONT=&quot] را مشخص می کند. بنابراین مقدار پروتئین نوترکیب حاصل به ویژگی ذاتی پروموتور مربوطه بستگی دارد.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]انتخاب پروموتور باید با دقت صورت گیرد. توالی های توافقی میانگینی از کل پروموتورهای شناخته شده [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] محسوب می شوند. با وجود این که بسیاری از پروموتورهای [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] با این توالی، تفاوت زیادی ندارند (مثلاً [/FONT][FONT=&quot]TTTACA[/FONT][FONT=&quot] به جای [/FONT][FONT=&quot]TTGACA[/FONT][FONT=&quot]) اما همین اختلافات جزئی اثرات شدیدی بر کارایی پروموتور کنترل کننده بیان ژن می گذارد. پروموتورهای قوی آنهایی هستند که سرعت بالایی از رونویسی را موجب می شوند و معمولاً ژن هایی را کنترل می کنند که سرعت بالایی از رونویسی را موجب می شوند و معمولاً ژن هایی را کنترل می کنند که محصولات ترجمه ای آنها در مقادیر بالایی برای سلول مورد نیاز هستند. در مقابل، پروموتورهای ضعیف نسبتاً ناکارامد هستند و بیان ژن هایی را بر عهده دارند که محصولات آنها در مقادیر اندک برای سلول مورد نیاز هستند. پر واضح است که یک حامل بیانی باید پروموتور قدرتمندی داشته باشد تا رونویسی ژن کلون شده در بالاترین مقدار ممکن صورت گیرد.[/FONT] [FONT=&quot]دومین عاملی که باید در ساخت یک حامل بیانی مورد توجه قرار گیرد، بررسی امکان تنظیم پروموتور است. دو نوع تنظیم ژنی در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] شناخه شده اند: القایی و مهاری. یک ژن القایی، ژنی است که رونویسی آن با اضافه شدن ماده شیمیایی خاصی به محیط کشت القاء می شود. این ماده شیمیایی اغلب یکی از سوبستراهای آنزیمی است که توسط ژن کدگذاری می شود. در مقابل، یک ژن مهاری ژنی است که با اضافه شدن ماده شیمیایی تنظیمی خاموش می شود.[/FONT] [FONT=&quot]تنظیم ژن فرآیند پیچیده ای است که بطور غیرمستقیم به خود پروموتور مربوط می شود. بسیاری از توالی های اطراف پروموتور که برای القا و مهار بیان ژن مهم هستند، در حامل بیانی هم وجود دارند. بنابراین امکان افزودن بخش تنظیمی به حامل بیانی نیز وجود دارد تا بتوان از مواد شیمیایی القا کننده و مهار کننده برای کنترل بیان ژن کلون شده استفاده کرد. این موضوع در تولید پروتئین های نوترکیب مزیت محسوب می شود. برای مثال اگر پروتئین نوترکیب اثر مضری بر باکتری داشته باشد در این صورت ساخته شدن آن باید محتاطانه صورت گیرد تا از تجمع مواد سمی آن در باکتری جلوگیری شود. این عمل را با استفاده از مواد شیمیایی تنظیمی می توان انجام داد. حتی اگر پروتئین کلون شده ضرری برای میزبان نداشته باشد، قابل تنظیم بودن آن ضروری است، زیرا رونویسی زیاد ممکن است بر توانایی همانندسازی و تکثیر پلاسمید نوترکیب اثر بگذارد و به حذف تدریجی آن از ارگانیسم بیانجامد.[/FONT] [FONT=&quot]تعدادی از پروموتورهای [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] هر دو جنبه قدرت و قابلیت تنظیم را دارند. متداول ترین پروموتورهایی که در حامل های بیانی استفاده می شوند، عبارتند از: پروموتور [/FONT][FONT=&quot]lac[/FONT][FONT=&quot]، پروموتور [/FONT][FONT=&quot]trp[/FONT][FONT=&quot]، پروموتور [/FONT][FONT=&quot]tac[/FONT][FONT=&quot]، پروموتور [/FONT][FONT=&quot]λ P[SUB]L[/SUB][/FONT][FONT=&quot]، پروموتور [/FONT][FONT=&quot]T[SUB]7[/SUB][/FONT][FONT=&quot].[/FONT] [FONT=&quot]یک حامل بیانی کارامد، علاوه بر داشتن یک پروموتور قوی و قابل تنظیم نیازمند توالی اتصال به ریبوزوم [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] و ترمیناتور نیز می باشد. در بسیاری از حامل ها این علایم بیانی یک کاست را تشکیل می دهند. این نامگذاری به این دلیل است که برای کلون سازی ژن بیگانه، آن را در میان جایگاه برش آنزیم محدود کننده ای که در وسط مجموعه علایم بیانی است، وارد می کنند. جاگیری ژن خارجی درون کاست، آن را در وضعیت ایده آلی نسبت به علایم بیانی قرار می دهد.[/FONT] [FONT=&quot]در مورد برخی از حامل های کاستی، جایگاه کلون سازی بلافاصله به توالی اتصال به ریبوزوم نچسبیده است، بلکه بعد از بخشی از ابتدای یک ژن [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] قرار دارد. وارد شدن ژن بیگانه به درون جایگاه برش آنزیم محدود کننده باید به شیوه ای صورت بگیرد که از نظر چارچوب خواندن با هم همخوانی داشته باشند. به این ترتیب، ژن هیبریدی حاصل می شود که شروع آن با ژن [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] است و بدون وقفه به کدون های ژن خارجی متصل می شود. بنابراین محصول بیان چنین ژنی، پروتئین فیوژن یا هیبریدی است که قسمت کوتاهی از پروتئین [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] به [/FONT][FONT=&quot]N[/FONT][FONT=&quot]-ترمینال پروتئین متصل شده است. این سیستم فیوژن چهار مزیت دارد:[/FONT] · [FONT=&quot]ترجمه کارامد [/FONT][FONT=&quot]mRNA[/FONT][FONT=&quot] ژن کلون شده نه تنها به وجود جایگاه اتصال ریبوزوم بستگی دارد، بلکه تحت تأثیر توالی چند نوکلئوتید اول ناحیه کد کننده نیز می باشد. این موضوع احتمالاً به این دلیل است که ایجاد ساختارهای ثانویه حاصل از جفت بازهای درون رشته ای، با اتصال ریبوزوم به جایگاه اتصال خود تداخل می کند. چنین احتمالی با قرار گرفتن بخشی از توالی های طبیعی [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] از بین می رود.[/FONT] · [FONT=&quot]وجود یک پپتید باکتریایی در ابتدای پروتئین ممکن است پایداری مولکول را افزایش دهد و از هضم شدن آن توسط سلول میزبان جلوگیری کند. در مقابل، پروتئین های بیگانه ای که فاقد بخش باکتریایی هستند، اغلب توسط میزبان هضم می شوند.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] · [FONT=&quot]بخش باکتریایی ممکن است دارای یک پپتید نشانه باشد که مسئول هدایت پروتئین [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] به جایگاه مناسبی در سلول است. اگر این پپتید نشانه مربوط به یک پروتئین ترشحی باشد (مثل محصول ژن های[/FONT][FONT=&quot]omp A[/FONT][FONT=&quot] و [/FONT][FONT=&quot]mal E[/FONT][FONT=&quot]) در این صورت ممکن است پروتئین نوترکیب به محیط کشت یا فضای پری پلاسمی میان غشاهای داخلی و خارجی سلول [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] ترشح شود. ترشحی بودن پروتئین تولید شده یک مزیت محسوب می شود، زیرا مسایل خالص سازی پروتئین نوترکیب را ساده می کند.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] · [FONT=&quot]بخش باکتریایی ممکن است قابل بازیابی با کروماتوگرافی تمایلی باشد و به خالص سازی پروتئین تولید شده کمک کند. برای مثال، فیوژن های دارای پروتئین گلوتاتیون-[/FONT][FONT=&quot]S[/FONT][FONT=&quot]-ترانسفراز [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] را می توان با استفاده از دانه های آگارزی که گلوتاتیون به آنها متصل شده است، جداسازی کرد.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]ایراد سیتم فیوژن این است که حضور بخشی از پروتئین [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] ممکن است ویژگی های پروتئین نوترکیب را تغییر دهد. بنابراین روش هایی برای حذف بخش باکتریایی نیاز است. معمولاً این کار از طریق تیمار پروتئین حاصل با مواد شیمیایی یا آنزیم هایی صورت می پذیرد که رشته پلی پپتید را در نزدیکی یا در محل اتصال بین پروتئین [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] و پروتئین خارجی برش می دهند.[/FONT][FONT=&quot] [/FONT][FONT=&quot]برای مثال، اگر یک متیونین در نقطه اتصال وجود داشته باشد، پروتئین حاصل را می توان با سیانوژن بروماید برش داد، زیرا سیانوژن بروماید پروتئین را از مجاورت آمینواسید متیونین می برد. از آنزیم هایی مانند ترومبین (که پروتئین را از مجاورت آمینواسید آرژینین برش می دهد) یا فاکتورها [/FONT][FONT=&quot]Xa[/FONT][FONT=&quot] (که در توالی گلایسین-آرژینین، بعد از آرژینین برش ایجاد می کند) نیز می توان برای برش بخش باکتریایی استفاده کرد. نکته مهم این است که توالی های شناسایی مواد برش دهنده نباید در ساختار پروتئین نوترکیب وجود داشته باشد.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]علی رغم وجود حامل های بیانی کارامد، هنوز هم مشکلات بسیاری بر سر راه تولید پروتئین های خارجی کلون شده در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] وجود دارد. این مشکلات را می توان به دو گروه تقسیم کرد: مشکلاتی که به خاطر توالی ژن بیگانه هستند و مشکلاتی که به محدودیت های استفاده از [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] به عنوان میزبان تولید پروتئین های نوترکیب برمی گردند.[/FONT] [FONT=&quot]مشکلات ناشی از توالی ژن بیگانه: توالی نوکلئوتیدی در سه حالت می تواند از بیان مناسب ژن کلون شده در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] جلوگیری کند:[/FONT] · [FONT=&quot]اگر ژن بیگانه دارای اینترون باشد. وجود اینترون یک مشکل بزرگ محسوب می شود زیرا ژن های [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] فاقد اینترون هستند و بنابراین باکتری فرآیند مناسبی برای حذف اینترونها از رونوشت ها ندارد.[/FONT] · [FONT=&quot]در توالی ژن بیگانه ممکن است بخشی وجود داشته باشد که به منزله علامت پایان رونویسی در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] است. این توالی ها در سلول میزبان طبیعی کاملاً بی مفهوم هستند اما در باکتری موجب خاتمه زودهنگام و عدم بیان پروتئین می شوند.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] · [FONT=&quot]الگوی استفاده از کدون ژن ممکن است برای ترجمه در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] ایده آل نباشد. گرچه تقریباً تمام موجودات زنده از یک نوع کد ژنتیکی استفاده می کنند اما در هر موجودی نسبت به کدون های خاصی تمایل بیشتری وجود دارد. این مسئله بر کارایی مولکول های [/FONT][FONT=&quot]tRNA[/FONT][FONT=&quot] که قادر به شناسایی چند کدون مختلف هستند، اثر می گذارد. اگر یک ژن کلون شده تعداد زیادی از کدون های نادر را داشته باشد، در این صورت [/FONT][FONT=&quot]tRNA[/FONT][FONT=&quot] های سلول میزبان در هنگام ترجمه به زحمت می افتند و نتیجه نهایی کاهش مقدار پروتئین ساخته شده است.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]با وجود این که دستکاریهای لازم برای حل چنین مشکلاتی پرهزینه و زمان بر هستند (در پروژه های صنعتی هر دو عامل هزینه و زمان اهمیت دارند)، اما این مشکلات معمولاً قابل حل هستند. اگر ژن اینترون داشته باشد، [/FONT][FONT=&quot]DNA[/FONT][FONT=&quot] مکمل ([/FONT][FONT=&quot]cDNA[/FONT][FONT=&quot]) آن که از [/FONT][FONT=&quot]mRNA[/FONT][FONT=&quot] تهیه شده و فاقد اینترون است می تواند جایگزین مناسبی برای کلون سازی باشد. از جهش زایی [/FONT][FONT=&quot]in vivtro[/FONT][FONT=&quot] می توان برای تغییر توالی ترمیناتورهای بالقوه و عوض کردن کدون های ناخواسته و نادر با کدون هایی که مورد تمایل [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] هستند، استفاده کرد. راه حل دیگر در مورد ژن هایی که کمتر از [/FONT][FONT=&quot]1kb[/FONT][FONT=&quot] طول دارند، ساخت مصنوعی آنها است. در این روش مجموعه ای از اولیگونوکلئوتیدها ساخته می شوند که با هم همپوشانی دارند و به هم می چسبند. توالی این اولیگونوکلئوتیدها به گونه ای طراحی شده است که دارای کدون های دلخواه [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] هستند و توالی ترمیناتور هم وجود ندارد.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]مشکلات ناشی از [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot]: بعضی از مشکلاتی که در هنگام استفاده از [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] به عنوان میزبان تولید پروتئین های نوترکیب دیده می شوند، مربوط به خصوصیات ذاتی باکتریها است. برای مثال:[/FONT] · [FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] ممکن است پروتئین نوترکیب را به درستی پردازش نکند. پروتئین های اکثر موجودات زنده پس از ترجمه پردازش می شوند، که شامل ایجاد تغییرات شیمیایی در آمینواسیدهای رشته پلی پپتیدی است. اغلب این فرآیندها برای فعالیت بیولوژیک پروتئین ضروری هستند. متأسفانه پردازش پروتئین های باکتریایی، مشابه پروتئین های موجودات زنده عالی تر انجام نمی شود. به عنوان مثال، پروتئین های برخی جانوران گلیکوزیله هستند، یعنی بعد از ترجمه، گروه های قند به پروتئین اضافه می شود، در حالی که گلیکوزیلاسیون در باکتری غیرمعمول است و بنابراین پروتئین های نوترکیب ساخته شده در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] به درستی گلیکوزیله نمی شوند. در [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] ممکن است تاخوردگی پروتئین نوترکیب به درستی صورت نگیرد. این مشکل به طور معمول از عدم توانایی ایجاد پل های دی سولفیدی که در پروتئین های جانوران فراوان هستند، ناشی می شود. اگر پروتئین ساختار سوم صحیح خود را نداشته باشد به صورت نامحلول درمی آید و در درون باکتری اجسام انکلوزیونی تشکیل می دهد. بازیابی پروتئین از اجسام انکلوزیونی مشکل نیست، اما در محیط آزمایشگاه، تبدیل کردن آن به پروتئینی که تاخوردگی صحیح داشته باشد، مشکل یا غیرممکن است. البته، تحت چنین شرایطی پروتئین غیرفعال است.[/FONT] · [FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] ممکن است پروتئین نوترکیب را هضم کند. این که دقیقاً چگونه [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] می تواند پروتئین بیگانه را شناسایی و نابود کند، شناخته نشده است.[/FONT][FONT=&quot][/FONT] [FONT=&quot]مشکلات ناشی از استفاده میزبان [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] سخت تر از مشکلات ناشی از توالی ژن مورد نظر برای کلون سازی هستند. هضم پروتئین نوترکیب را می توان با استفاده از میزبان [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] جهش یافته ای که یک یا چند پروتئاز دخیل در هضم پروتئین را ندارد، کاهش داد. تاخوردگی صحیح پروتئین نوترکیب را می توان با انتخاب سویه های مناسب بهبود بخشید، مثل سویه هایی که چاپرون های بیشتری تولید می کنند. چاپرون ها در تاخوردگی پروتئین ها نقش دارند. اما مشکل اصلی، ناتوانی در گلیکوزیلاسیون است. ثابت شده است که استفاده از [/FONT][FONT=&quot]E. coli[/FONT][FONT=&quot] برای تولید چنین پروتئین هایی محدودیت دارد.[/FONT]
 
بالا