تكنيك توليد آنتی بادی منوكلونال

P O U R I A

مدیر مهندسی شیمی مدیر تالار گفتگوی آزاد
مدیر تالار
بخش اول: مقدمه و كليات
سيستم ايمنی با روش های مختلف با ميكروب ها، سلول ها و ملكول های خارجی ( آنتی ژن ) مقابله می كند. يكی از پاسخ های اختصاصی اين سيستم در برابر آنتی ژنها، توليد آنتی بادی است. در ساختمان هر ملكول آنتی ژن، نواحی وجود دارد كه توسط سيستم ايمنی شناسايی می شود. اين نواحی اصطلاحاً اپيتوپ ( epitope ) ناميده می شوند.
امروزه می دانيم كه لنفوسيت های بدن ما قادرند بيش از 109 اپيتوپ مختلف را شناسايی كنند و بطور طبيعی قبل از مواجه شدن با اين اپيتوپ ها گيرنده های اختصاصی برای آنها در سطح اين سلول ها وجود دارد.
هر لنفوسيت B قادر است تنها يك نوع اپيتوپ را شناسايی كرده و تنها يك نوع آنتی بادی اختصاصی عليه اين اپيتوپ بسازد. هنگاميكه يك آنتی ژن كه حاوی چندين اپيتوپ است وارد بدن می شود با انواع مختلفی از لنفوسيت ها مواجه می شود كه هر يك قادرند اپيتوپ خاصی را شناسايی كنند.
لنفوسيت های مولد آنتی بادی اختصاصی برای هر يك از اپيتوپ های مربوطه با مكانيسم های ويژه ای تكثير و تمايز پيدا كرده و يك كلون لنفوسيتی را بوجود می آورند. بنابراين تزريق يك آنتی ژن با اپيتوپ های متعدد باعث القاء تكثير و تمايز چندين كلون لنفوسيتی و متعاقب آن توليد چندين نوع آنتی بادی می شود، به همين دليل سرم حيوان دريافت كننده آنتی ژن، حاوی آنتی باديهای پلی كلونال است .
در صورتيكه بتوان يك كلون لنفوسيتی را كه از يك سلول مادر تكثير شده است جدا كرد، آنتی باديهای توليد شده توسط اين سلول ها فقط يك اپيتوپ معين را در ملكول آنتی ژن شناسايی خواهند كرد. به اين نوع آنتی باديها اصطلاحأ آنتی باديهای منوكلونال گفته می شود. عملاً جدا كردن لنفوسيت های مربوط به يك كلون، كار بسيار دشواري است. از طرفي نگهداري اين سلول ها در محيط كشت ( In Vitro ) نيز دشوار است و حداكثر يك هفته تا 10 روز در شرايط مناسب و ايده آل می توان آنها را زنده نگهداشت.
توليد آنتی بادی منوكلونال با استفاده از تكنولوژی توليد سلول هيبريدوما اولين بار توسط دو دانشمند بنام های Cesar Milstein و Georges Kohler در سال 1975 ابداع شد. در اين تكنولوژی سلول های مولد آنتی بادی با سلول های میلومایی ادغام می شوند. سلول های ميلومایی در حقيقت سلول های ناميرا مربوط به تومور لنفوسيت های B تكامل نيافته يا پلاسموسيت است و هدف از ادغام سلول مولد آنتی بادی با سلول ميلوما اين است كه يك سلول ناميرا با خاصيت توليد آنتی بادی بدست آيد. بنابراين سلول هيبريد بدست آمده می تواند تقريبأ بطور نامحدود تكثير شده و آنتی بادی توليد كند. در صورتيكه سلول های هيبريد بدست آمده از يك منشاء و يك سلول واحد تكثير شده باشند، آنتی بادی توليد شده توسط اين هيبريد منوكلونال خواهد بود.
در اين بخش بطور متوالی و در شماره های مختلف، جزئيات مراحل و روش های مربوط به توليد آنتی بادی منوكلونال با روش توليد سلول های هيبريد، تشريح خواهد شد. همچنين ساير روش های ايمونوشيمی كه اغلب در ارتباط با تعيين مشخصات و بكارگيری اين آنتی باديها در تشخيص، درمان و تحقيقات پايه می باشند مورد بحث و بررسی قرار خواهند گرفت. ذيلأ فهرست اجمالی از روش های لازم برای توليد سلول های هيبريدوما و توليد آنتی بادی منوكلونال آورده شده است كه در شماره های آينده بتدريج با جزئيات بيشتر بحث خواهند شد.
1) ايمونيزاسيون ( Immunization )
الف) آماده سازی آنتی ژن برای تزريق
ب) روش های ايمونيزاسيون
2) كشت سلولی ( Cell Culture )
الف) رشد رده سلول های ميلومايی
ب) جداسازی سلول های طحال از موش ايمن شده
3) فيوژن ( Fusion ) يا ادغام سلولی
4) غربالگری (Screening) سلو لهای هيبريد مولد آنتی بادی
5) كلونينگ ( Cloning) هيبريدهای مولد آنتی بادی
6) نگهداری دراز مدت هيبريدها
7) روش های توليد انبوه آنتی باديها
8) روش های تخليص آنتی بادی منوكلونال
9) تعيين مشخصات آنتی باديهای منوكلونال
الف) تعيين ايزوتيپ​
ب ) تعيين ويژگی ( Specificity )​
ج ) تعيين ثابت افينيتی ( Affinity Constant )​
د ) تعيين اپيتوپ مورد شناسايی ( Epitope Mapping )​




منبع: پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی- انستیتو ابن سینا


گردآورنده: امیرحسین یگانه مهر
 

P O U R I A

مدیر مهندسی شیمی مدیر تالار گفتگوی آزاد
مدیر تالار
ايمونيزاسيون ( Immunization )

ايمونيزاسيون ( Immunization )

ايمونيزاسيون ( Immunization )


در اين بخش اولين مرحله در توليد آنتی بادی منوكلونال يعنی ايمن كردن حيوانات را مطالعه خواهيد كرد. بدلايل متعدد برای انجام فيوژن اغلب از موش های سفيد كوچك استفاده می شود.
شباهت فيزيولوژيكی موش با انسان، كوتاه بودن دوره توليد مثل و سهولت در نگهداری و تكثير موشها از مهمترين دلايل آن بشمار می آيد. از طرفی چون فرآيند ايمونيزاسيون نسبتأ طولانی است برای پيشگيری از بارداری موش ها بايد آنها را از يك جنس، نر يا ماده انتخاب كرد. بدليل خشن بودن موش های نر، در طی زمان تزريقات آنتی ژن اين موشها بطور متوالی با يكديگر درگير شده و احتمال مرگ و مير يا مجروح شدن آنها بالاست لذا دراغلب تحقيقات از موش های ماده برای ايمونيزاسيون استفاده می شود. از طرفی چون در هر حالت امكان از بين رفتن موش ها وجود دارد و از طرف ديگر احتمال موفقيت عمل فيوژن و رسيدن به آنتی بادی مورد نظرصد درصد نيست بهتر است كه تزريق آنتی ژن بطور همزمان در چند موش انجام گيرد. اغلب آنتی ژن ها قبل از تزريق بايستی آماده شوند كه در اينجا مراحل آماده سازی آنها مورد بررسی بيشتر قرار می گيرد.
الف) آماده سازی آنتی ژن: آنتی ژنها معمولأ يا بصورت مايع و محلول و يا بصورت پودر ليوفليزه شده هستند. درصورتيكه آنتی ژن بصورت پودر باشد بهتر است ابتدا در بافر PBS استريل، سالين استريل يا آب مقطر استريل حل شود كه اين بستگی به ميزان حلاليت آنتی ژن نيز دارد. گاهی اوقات حلاليت آنتی ژن كم است بخصوص پروتئين های بسيار هيدروفوب، كه در اينصورت ميتوان از كمی دترجانت نيز برای افزايش حلاليت استفاده كرد. معمولاً ميزان دترجانت بايد كمتر از 2/0 درصد باشد. پس از حل شدن آنتی ژن بايستی با محلول ويژه ای بنام
ادجوانت مخلوط گردد. بطور كلی ادجوانت ممكن است حاوی برخی ميكروب های ضعيف شده نيز باشد كه در اينصورت به آن ادجوانت كامل گفته می شود و اگر فاقد ميكروارگانيسم ضعيف شده باشد، ادجوانت ناقص نام دارد. از ادجوانت كامل معمولاً در تزريقات اول استفاده می شود و هدف از بكارگيری آن تحريك بيشتر سيستم ايمنی ميزبان برای ايجاد پاسخ قويتر است. در تزريقات دوم و بعد از آن ديگر نيازی به استفاده از ادجوانت كامل نيست و می توان از ادجوانت ناقص كه فاقد ميكروب های ضعيف شده است، استفاده كرد. برای آماده كردن آنتی ژن ابتدا به كمك يك سرنگ حجم مورد نياز از محلول آنتی ژن را برداشته، سپس با يك سرنگ ديگر از ادجوانت كامل/ناقص با حجم مساوی با حجم آنتی ژن برداشته و پس از هواگيری توسط يك رابط
سرنگی اين دوسرنگ بهم متصل می شوند. در مرحله بعد بطور متوالی محتويات هر سرنگ به سرنگ ديگر منتقل می شود، اين عمل آنقدر انجام می شود تا محلول داخل سرنگ ها بصورت امولسيون پايدار درآيد . بدين ترتيب كه اگر يك قطره از امولسيون ايجاد شده را روی يك ظرف آب بريزيم قطره ثابت و بصورت نقطه ای باقی بماند در اينصورت آنتی ژن آماده تزريق می باشد، در غير اينصورت بايستی به هم زدن ادامه داد. بدين تر تيب ادجوانت ها بدو طريق به ايمونيزاسيون كمك مي كنند اول اينكه سيستم ايمني را تحريك مي كنند و به آنتی ژن پاسخ قويتری داده می شود، دوم اينكه پس از مخلوط شدن آنتی ژن با ادجوانت شكل امولسيون غليظ ايجاد می شود كه قادر است آنتی ژن را بتدريج وارد بدن ميزبان نمايد و طول مدت زمانی كه سيستم ايمنی در معرض آنتی ژن قرار دارد طولانی تر مي شود.
ب) روش های ايمونيزاسيون روش های متعددی برای ايمن كردن حيوانات گزارش شده است كه در اينجا بطور اجمال مهمترين و شايع ترين روش های مورد استفاده بحث مي شود.
1) ميزان آنتی ژن تزريقی توصيه می شود كه در مايع امولسيون حاوی آنتی ژن، غلظت آنتی ژن بين 250-50 ميكروگرم در ميلی ليتر باشد. اما در مورد ايمونوژن های خيلی ضعيف گاهی تا يك ميلی گرم در ميلی ليتر نيز استفاده شده است. در مواردی نيز كه آنتی ژن خيلی گران قيمت و يا كمياب باشد بين 10-2 ميكروگرم در ميلی ليتر نيز تزريق شده است ؛ اما لازم به توضيح است كه در تزريقات با غلظت های خيلی كم بخصوص برای ايمونوژن های متوسط و ضعيف درصد موفقيت فيوژن بشدت كاهش می يابد. علاوه بر اين ميزان آنتی ژن تزريقی، به نژاد، سن و وزن حيوان نيز بستگی دارد. لذا پيدا كردن مقدار بهينه تزريق به حيوانات، می تواند تا حدود زيادی با تجربه نيز بدست آيد. توصيه می شود افراديكه برای اولين بار از يك آنتی ژن خاص استفاده می كنند قبل از تزريق آنتی ژن، منابع معتبر برای تعيين حدود ميزان آنتی ژن تزريقی را مطالعه كنند.



گردآورنده : جناب آقای امیرحسین یگانه مهر


منبع : پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی- انستیتو ابن سینا
 

P O U R I A

مدیر مهندسی شیمی مدیر تالار گفتگوی آزاد
مدیر تالار
2) تعداد تزريقات و فواصل زمانی بين تزريقات:
در مورد تعداد و فواصل زمانی نيز شيوه های متعددی در مقالات متفاوت گزارش شده است. معمولأ فواصل 2 تا 3 هفته برای موش در نظر گرفته می شود معمولأ در صورتيكه ايمونوژن خيلی ضعيف نباشد پس از تزريق سوم موش ايمن می شود. گاهی لازم است تزريقات چهارم و پنجم نيز انجام شود. بطور كلی توصيه می شود كه دوزهای كم آنتی ژن در تعداد دفعات بيشتر تزريق انجام شود. اين روش بهتر از تزريقات با غلظت زياد و تعداد دفعات كم است.
3) محل تزريقات در بدن موش
معمولأ نواحی مختلفی از بدن موش برای تزريق استفاده می شود تزريقاتی كه معمولأ برای ايمونيزاسيون انجام می شود شامل:
تزريق جلدی ( Intradermal Injection )،
تزريق زير جلدی ( Subcutaneous Injection )،
تزريق عضلانی ( Intramuscular Injection )،
تزريق داخل صفاقی ( Intraperitoneal Injection )
كه در اشكال 1و 2 بطور دقيق نشان داده شده اند.



شكل (1): دياگرام مربوط به نحوه تزريقات جلدی، زير جلدی و عضلانی



شكل (2): دياگرام مربوط به نحوه تزريق داخل صفاقی


از ميان اين روش ها، تزريق صفاقی يا تركيبی از تزريق صفاقی و عضلانی بيشتر از ساير روش ها استفاده می شود . علا وه بر نواحی فوق، برخی از محققين از روش تزريق در كف پای موش نيز استفاده می كنند.


معمولأ 4-3 روز قبل از انجام فيوژن آخرين تزريق با آنتی ژن محلول و بدون استفاده از ادجوانت بصورت داخل رگی ( Intravenous Injection ) نيز انجام می گيرد. بهترين رگ برای اين تزريقات، وريد دم موش است . برای اين منظور ابتدا بايستی موش را طوری مهار كرد كه براحتی دم آن در اختيار باشد. معمولأ می توان نوك يك لوله 50 ميلی ليتری مخروطی را برش زد و درب آنرا در مركز به اندازه دم موش سوراخ كرد سپس موش را وارد لوله نموده و دم موش را از سوراخ مركزی درب عبور داد و در ب را محكم بست. در اينصورت با كشيدن دم و يافتن رگ می توان بداخل آن تزريق كرد. گاهی برای متورم شدن رگ می توان از گزيلل نيز استفاده كرد.


منبع : پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی- انستیتو ابن سینا


گردآورنده : جناب آقای امیرحسین یگانه مهر
 

P O U R I A

مدیر مهندسی شیمی مدیر تالار گفتگوی آزاد
مدیر تالار
1) كشت سلولی:
كشت رده سلولهای ميلومايی:
جهت توليد آنتی باديهای منوكلونال به نوعی سلول رده ميلومايی موش كه قابليت رشد در آزمايشگاه را داشته باشد ولی خود توليدكننده آنتی بادی نباشد، نياز است. معروفترين اين سلولها SP2/O نام دارد كه از منشأ موشهای سفيد Balb/c می باشد. از خصوصيات اين سلولها اين است كه قابليت رشد در محيط حاوی آمينوپترين را ندارند و در اين محيط كشت كه محيط HAT ناميده می شود، می ميرند ولی در محيط كشت معمولی مثل RPMI-1640 يا DMEM و در مجاورت آنتی بيوتيكهای پنی سيلين و استرپتومايسين و 10% سرم جنين گاو (FCS) براحتی رشد می كنند. لذا، قبل از اقدام به عمل فيوژن بايستی اين سلولها كشت داده شده و به مقدار كافی تكثير اين شوند و درصد زنده ( Viability ) سلولها تعيين گردد. به منظور تعيين درصد زنده سلولهای ميلوم، بايد پس از كشت اين سلول ها و تكثير آنها، اين سلولها را به نسبت يك حجم سلول و 9 حجم محلول رنگ تريپان بلو مخلوط كرده و مقداری از اين مخلوط را زير لام هم وسيتومتر كه برای شمارش سلولی استفاده می شود، قرار ميدهيم. رنگ تريپان بلو يك رنگ حياتی است كه سلولهای زنده آن را جذب نكرده و بی رنگ باقی می مانند درحاليكه سلولهای مرده آنرا جذب كرده و به رنگ آبی ديده می شوند. جهت شمارش سلولی، تعداد سلولهای مرده و زنده را شمارش كرده و درصد سلولهای زنده را در مجموع سلولها محاسبه می نمائيم. ترجيحأ جهت انجام فيوژن، بايستی درصد سلولهای زنده بالاتر از 90% باشد.
سلولهای مغذی ( Feeder Cells ):
سلولهای مغذی در واقع ماكروفاژهای صفاقی موش های Balb/c هستند. جهت بدست آوردن اين سلولها يك موش Balb/c را كشته و پس از بازكردن پوست در شرايط استريل سوراخ كوچكی در ناحيه صفاق آن ايجاد كرده و با پيپت پاستور حدود 5 ميلي ليتر محيط كشت بدون سرم را وارد ناحيه صفاقی كرده و پس از چند بار به هم زدن، سوسپانسيون سلولی را جمع آوری می نمائيم. اين محلول شامل ماكروفاژهای صفاقی است . تعداد ماكروفاژها را شمارش كرده و در هر چاهك پليت 96 چاهكی، 50 ميكرو ليتر ( حاوی5000 ماكروفاژ ) از اين سوسپانسيون سلولی را ( غلظت سوسپانسيون سلولی بايد 000/100 در هر ميلی ليتر باشد) اضافه می نمائيم. تهيه لايه سلولهای مغذی يك روز قبل از انجام فيوژن صورت می گيرد تا اين سلولها بتوانند به مقدار كافی فاكتورهای رشد را توليد كنند. ضمنأ وجود هرگونه آلودگی ميكروبی، قبل از اضافه كردن سلولهای فيوژن مشخص خواهد شد.
2) جداسازی سلولهای طحال از موش ايمن شده:
پس از اطمينان از ايمونيزه بودن موش كه از طريق آزمون رقت های مختلف سرم موش و اندازه گيری تيتر آنتی بادی موجود در سرم آن بر عليه آنتی ژن مربوطه انجام می گردد، موش را كشته و طحال آن را در شرايط استريل خارج می نمائيم. سپس حدود 5 ميلی ليتر محيط كشت بدون سرم را با يك سرنگ بداخل طحال تزريق نموده و اين كار را با همان محيط كشت چندين مرتبه تكرار می كنيم تا كليه سلولهای طحال خارج شوند. اين سوسپانسيون سلولی را چندين مرتبه از داخل سرنگ واجد سوزن عبور ميدهيم ( با فشار كم ) تا سلولها در سوسپانسيون يكنواخت قرار گيرند. سپس سلولها را شمارش می نمائيم.
3) فيوژن سلولی:
جهت انجام فيوژن يا ادغام سلولی، با توجه به تعداد لكوسيت های موجود در طحال، سلولهای ميلوم و لكوسيتهای طحال را به نسبت 1:10 در يك لوله 50 ميلی ليتری مخلوط كرده و 3 مرتبه با محيط كشت بدون سرم و سانتريفوژ ( 5 دقيقه در 2000 دور در دقيقه ) شستشو ميدهيم. پس از آخرين شستشو و تخليه مايع رويی، آخرين قطره محيط كشت را با پيپت پاستور خارج كرده سپس سلولها را تا حد امكان هم ميزنيم تا كاملأ يكنواخت شوند. سپس 8/0 ميلی ليتر پلی اتيلن گليكول ( PEG ) 1500 را كه در انكوباتور C°37 نگهداری نموده ايم قطره قطره طی مدت يك دقيقه به سلولها اضافه كرده و دائمأ سلولها را هم ميزنيم. در مرحله بعد 10 ميلی ليتر محيط كشت بدون سرم C°37 را با آرامی و در مدت 2-1 دقيقه به سلولها اضافه می كنيم و سپس با محيط بدون سرم C°37 حجم سلولها را به 50 ميلی ليتر رسانده و مثل قبل سانتريفوژ C°37 می كنيم . محلول رويی را تخليه نموده و يك مرتبه ديگر سلولها را با 50 ميلی ليتر محيط كشت بدون سرم شستشو ميدهيم. پس از خالی نمودن محلول رويی، سلولها را در 50 ميلی ليتر محيط كامل ( حاوی آنتی بيوتيكها و FCS ) رقيق كرده و با يك سمپلر 8 شاخه، سوسپانسيون سلولی را در 5 پليت 96 چاهكی ( 50 ميكروليتر در هر چاهك ) حاوی سلولهای مغذی توزيع میكنيم.


منبع : پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی- انستیتو ابن سینا
گردآورنده : جناب آقای امیرحسین یگانه مهر
 

P O U R I A

مدیر مهندسی شیمی مدیر تالار گفتگوی آزاد
مدیر تالار
4) غربالگری سلولهای هيبريد توليد كننده آنتی بادی اختصاصی:
پس از گذشت يك روز از كشت سلولهای هيبريدوم به هر يك از چاهكها 100 ميكروليتر محيط كشت كامل حاوی HAT-2x اضافه می نمائيم. در اين حالت آمينوپترين موجود در HAT باعث مرگ سلولهای ميلوم SP2/0 می شود و سلولهای طحال كه فيوز نشده اند قدرت تكثير نداشته و پس از چند روز می ميرند . در محيط HAT فقط سلولهای هيبريدوم حاصل از فيوژن سلولهای SP2/0 و سلولهای طحال زنده مانده و رشد می كنند. اين سلولها قدرت رشد و تكثير خود را از سلولهای SP2/0 و قدرت بقا در محيط HAT را از سلولهای طحال گرفته اند. پس از 2 نوبت تعويض محيط كشت، رشد سلولهای تمامی چاهكها در زير ميكروسكوپ معكوس بررسی و محلول رويی سلولهايی را كه به اندازه كافی رشد كرده اند از لحاظ وجود آنتی بادی اختصاصی بر عليه آنتی ژن مورد نظر آزمايش می كنيم ( معمولأ از روش ELISA برای سنجش تيتر آنتی بادی استفاده میشود ). در صورت وجود چاهك مثبت، سلولهای آن چاهك را با استفاده از روش رقت سلولی ( Limiting dilution ) كلون می نمائيم.

5) كلونينگ هيبريدهای مولد آنتی بادی اختصاصی:
سلولهای چاهكهای مثبت را كه حاوی سلولهای مولد آنتی بادی اختصاصی عليه آنتی ژن مورد نظر هستند، به روشی كه قبلأ ذكر شد شمارش مینمائيم، سپس در يك پليت 96 چاهكی كشت سلول اين سلولها را به روش ذيل تقسيم می نمائيم:
در سه ستون اول پليت، در هر چاهك 10 سلول در حجم 50 ميكروليتر اضافه می كنيم. در چهار ستون بعد، در هر چاهك 20 سلول در حجم 50 ميكروليتر و در 5 ستو ن آخر، در هر چاهك يك سلول در همان حجم اضافه می كنيم. برای حمايت از رشد سلولها در اين غلظت كم در روز قبل از شروع كلونينگ به هر يك از چاهكها 5000 سلول مغذی ( مثل قبل ) در 50 ميكروليتر محيط كشت اضافه می كنيم و يا محلول رويی كشت سلولهای SP2/0 را كه به نسبت 5/1 رقيق شده است به حجم 50 ميكروليتر می افزائيم. سپس اجازه ميدهيم كه كشت سلولی سلولهای كلون شده ادامه يابد و پس از هفته اول كشت، هر روز تمامی چاهكها را از لحاظ نوع رشد سلولها بررسی می كنيم. در شرايطی كه فقط يك مجموعه سلولی رشد كرده باشند، آن را يك كلون سلولی میناميم و پس از رشد كافی آن مجموعه، محلول رويی آن را تست می نمائيم . در صورت مثبت بودن ، سلولهای آن چاهك را مجدداً به روش فوق كلون می نمائيم و دوباره اقدام به جدا نمودن كلونهای تكی می نمائيم. در صورتی كه يك كلون مثبت سلولی منوكلون باشد، كليه كلونهای منتج از آن بايد آنتی بادی اختصاصی را توليد كنند و در واقع دليل نامگذاری آنتی بادی منوكلونال برروی آنتی بادی حاصل از اين روش نيز اين
است كه اين آنتی بادی از يك منوكلون يا يك كلون خالص سلولی حاصل از رشد يك سلول منفرد بدست آمده است.

6) نگهداری دراز مدت هيبريدوم ها:
پس از دستيابی به يك كلون هيبريدوم خالص بايد به اندازه كافی از آن ذخيره داشته باشيم. لذا سلول مزبور را به تعداد زياد تكثير نموده و اقدام به فريز نمودن آنها جهت نگهداری طولانی مدت می نمائيم. برای اين كار به هر ويال فريز سلولی ( Cryotube ) حدود 6 ميليون سلول با درصد سلول زنده بيش از 95% در حجم كمتر از 100 ميكروليتر اضافه كرده و به آنها يك ميلی ليتر محلول فريز سلولی اضافه می كنيم ( محلول فريز سلولی شامل 70% محيط كشت، 20% FCS و 10% دی متيل سولفوكسيد DMSO می باشد ). سپس ويالها را طوری بسته بندی می نمائيم كه در °70- دمای آنها در هر دقيقه حدود يك درجه سانتيگراد تقليل يابد . پس از يك شب نگهداری در °70- ، ويالها را به نيتروژن مايع با دمای °196- منتقل كرده و برای مدتهای طولانی نگهداری می نمائيم.





گردآورنده: جناب آقای امیرحسین یگانه مهر


منبع: پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی- انستیتو ابن سینا
 
بالا