[بیوتکنولوژی] - (Alkaline Phosphatase(ALK

[P O U R I A]

آلکالن فسفاتاز (EC.3.1.3.1) نوعی فسفاتاز است که استرهای آلی اسید فسفریک را در PH قلیایی (5/10-9) هیدرولیز می کند و فسفات را آزاد می نماید. همانند اسید فسفاتاز از دسته آنزیم های هیدرولاز می باشد. آلکالن فسفاتاز آنزیم غشاء سلولی است و در بسیاری از بافتهای بدن یافت می شود اما در روده، استخوان، کبد، کلیه و جفت زیاد است و در کبد و استخوان از همه بیشتر است. آلکالن فسفاتاز 8 عدد ایزوآنزیم دارد که در سه گروه جای می گیرند:


1- ایزوآنزیم روده ای
2- ایزوآنزیم جفتی
3-ایزوآنزیم غیر جفتی شامل کبدی، ریوی، استخوانی، طحالی و ایزوآنزیم غیر طبیعی یا آتی پیک یا tumor isoenzyme یا ایزوآنزیم ریگان(regan) که در زمان جنینی تولید می شود و بعد از تولد افزایش آن در سرم می تواند حاکی از سرطان باشد. این آنزیم به یون mg2+ به عنوان فعال کننده نیاز دارد و برخی از یونهای دیگر از جمله mn2+ و Co2+ نیز آنزیم را فعال می کنند. آلکالن فسفاتاز در افراد با گروه خونی O یا B بیشتر از افراد با گروههای خونی A یا AB می باشد که به دلیل تفاوت در میزان ایزوآنزیم روده ای می باشد.





کاربرد بالینی


آزمایش آلکالن فسفاتاز به عنوان یک تومور مارکر و یا شاخص بیماری های کبدی و استخوانی مطرح می باشد. آلکالن فسفاتاز حساس ترین آزمایش برای متاستاز تومور به کبد می باشد.


روش های اندازه گیری


چون این آنزیم نسبتا دارای یک سوبسترای اختصاصی نمی باشد، برای اندازه گیری آن روش های مختلفی ابداع شده است که اختلاف عمده بین این روش ها در غلظت و نوع سوبسترا، تامپون و PH واکنش می باشد. در اکثریت این روش ها از پارا نیترو فنیل فسفات به عنوان سوبسترا استفاده می شود.


اصول آزمایش:


P-Nitrophenylphosphate + H2O =====ALK===> Phosphate+P-Nitrophenol


افزایش فعالیت آلکالن فسفاتاز: ایزوآنزیم استخوانی در کودکان تا سه برابر نرمال افزایش دارد که علت آن فعالیت شدید استئوبلاستهای استخوان است. این سلولها در بافت استخوانی آلکالن فسفاتاز ترشح می کند. ایزوآنزیم جفتی در زنان حامله در سه ماهه دوم و سوم تا دو برابر نرمال افزایش دارد. ایزوآنزیم روده ای پس از مصرف غذاهای چرب افزایش دارد به همین دلیل جهت انجام آزمایش آلکالن فسفاتاز باید بیمار ناشتا باشد. در کلستاز(cholestasis)، انسداد مجاری صفراوی، یرقانهای انسدادی، کیست و آبسه کبدی آلکالن فسفاتاز سرم شدیدا افزایش می یابد. در تمام موارد فوق به علت انسداد مجاری صفراوی، صفرا همانند یک دترجنت روی غشاء سلول های کبدی اثر گذاشته و موجب آزاد شدن آلکالن فسفاتاز می گردد، در حالی که در ضایعات خود سلولهای کبدی که SGOT و SGPT افزایش دارند، آلکالن فسفاتاز افزایش نمی یابد. در بیماریهای استخوانی و کلا مواردیکه فعالیت استئوکلاستها زیاد است مانند پاژت، راشیتیسم(Rickets)، استئومالاسیا، هیپرپاراتیروئیدیسم، شکستگی استخوان ایزوآنزیم استخوانی افزایش می یابد. در کارسینوما ایزوآنزیم ریگان افزایش می یابد.





کاهش فعالیت آلکالن فسفاتاز: فعالیت آلکالن فسفاتاز درهیپوفسفاتازی که یک ناهنجاری ارثی متابولیسم استخوان می باشد کاهش می یابد. کاهش فعالیت آلکالن فسفاتاز در کمبود روی نیز اتفاق می افتد. تزریق خون و احیاء قلبی- ریوی اغلب موجب کاهش میزان آلکالن فسفاتاز می شوند. این اثرمی تواند به واسطه شلاته کردن کاتیون های ضروری توسط سیترات باشد. در آنمی پرنیشیوز، سوء تغذیه و اسکوروی میزان این آنزیم کاهش می یابد.

 

[P O U R I A]

اتوماسیون در بیوشیمی


تاریخچه


در ایام گذشته آزمایش های تشخیص پزشکی توسط پزشکان انجام می شد ( ابوعلی سینا)
در سال 1916 دکتر Todd در دانشگاه کلرادو بخش آسیب شناسی بالینی را ایجاد کرد.
دستگاه رنگ سنج Klett Biocolorimeter در دهه 1930 ابداع شد.
در دهه 1940 فوتومتر و اسپکتروفتومتر ابداع شد (روش های دستی)
در دهه 1950 برای اولین بار توسط شرکت Technicon آمریکا دستگاه اتو آنالایزر به بازار عرضه شد.


روش های جذب سنجی


وش های جذب سنجی یکی از قدرتمندترین و رایج ترین روش های اندازه گیری طیف وسیعی از آنالیت ها محسوب می شوند. بسیاری از دستگاه های مورد استفاده در آزمایشگاههای تشخیصی بر پایه اندازه گیری میزان جذب یا عبور انرژی تشعشعی ساخته شده اند.
اسپکتروفتومتر یا فتومتر ابزاری است که برای اندازه گیری انرژی جذبی یا عبوری نور مورد استفاده قرار می گیرد.
تشعشع الکترومغناطیسی (EMR) جریانی از انرژی است که با سرعت نور در جهان انتشار می یابد. و به صورت امواج ماکسول و جریانی از ذرات تحت عنوان فوتون وجود دارد.
طیف فرکانس های EMR از مقادیر بسیار پایین در مورد امواج رادیویی تا مقادیر بالاتر از جمله امواج فرابنفش، اشعه ایکس و اشعه گاما متفاوت است.


جنس و خواص نور:


نور در واقع نوعی انرژی با خاصیت دو گانه موج و ذره است.
یک موج الکترومغناطیسی از دو جزء الکتریکی و مغناطیسی با مولفه های عمود بر هم در راستای جهت انتشار تشکیل شده است.
نوری که معمولا در درجه حرارت های بالاتر از مواد ساطع می شود علاوه بر خاصیت الکتریکی دارای خاصیت مغناطیسی نیز می باشد.


قوانین بیر- لامبرت(Beer-Lamberts):


هرگاه یک نور ساده تکفام با شدت I0 عمود بر سطح تابش وارد یک محلول شفاف و یکنواخت به ضخامت L و غلظت C گردد بخشی از آن جذب شده قسمتی منعکس و قسمت دیگر از محلول عبور می کند بنابراین:
Ir+Ia+lt=I0

Ir: بخش انعکاس یافته است که میزان ناچیزی را به خود اختصاص می دهد.
Ia: بخش جذب شده که به غلظت آنالیت بستگی دارد.
It: بخش عبور کرده از محلول می باشد.


طبق نظر لامبرت هرگاه یک دسته شعاع نور تکفام(I) از محلولی به ضخامت L عبور کند کم شدن شدت نور متناسب با ضخامت محلول خواهد بودdI~L
طبق نظر بیر هرگاه یک دسته شعاع تکفام از محلولی به غلظت C عبور کند کم شدن شدت نور متناسب با غلظت آنالیت در محلول می باشد.


دستگاههایی که برای جذب سنجی به کار می روند عبارتند از: فتومترها و اسپکتروفتومترها


در فتومترها از فیلتر به عنوان تکفام ساز(Monochoromator) استفاده می شود لذا بخش محدودی از طول موج قابل دسترسی می باشد اما در اسپکتروفتومترها منشور و سیستمهای (Grating) به عنوان تکفام ساز عمل می کنند.

 

[P O U R I A]

فتومترها و اسپکتروفتومترها:


اسپکتروفتومتر دستگاهی است که جذب یا عبور طول موجهای مشخصی از انرژی تابشی(نور) از یک آنالیت را در یک محلول مشخص می سازد بر اساس قانون بیر و لامبرت مقدار نوری که در این طول موج مشخص جذب می شود مستقیما با غلظت آن نمونه شیمیایی متناسب است.


اجزاء دستگاه:


شش قسمت اصلی در ساختمان اسپکتروفتومترها وجود دارد که عبارتند از:


1) منبع نور
2) مونوکروماتور
3) متمرکز کننده پرتو
4) محل نمونه
5) آشکارساز
6) دستگاه نمایش خروجی



1) منبع نور:
منبع نور در اثر افزایش حرارت به کمک الکتریسیته در یک لامپ تامین می شود شرایط اصلی این منبع شدت کافی پایداری و پیوستگی اجزاء آن است.
برای تامین نور مرئی از لامپ های تنگستن استفاده می شود.
برای تولید پرتوهای فرابنفش از لامپهای هیدروژنی یا دوتریومی بهره گرفته می شود.


2) تکفام ساز:
این قسمت دستگاه پرتو چند فام را به پرتو تکفام تبدیل می کند این عمل ممکن است توسط منشور یا سیستم گریتینگ انجام شود.
فیلترها شیشه های رنگی هستند که بخش اعظم پرتوها را جذب کرده و فقط طول موج های محدودی را عبور می دهند.
فیلترها باید پرتویی را که آنالیت جذب می کند از خود عبور دهند.
منشورها و سیستم گریتینگ بر اساس اختلاف ضریب شکست می توانند طول موجهایی حتی با پهنای 1/0 نانومتر تولید کنند.
سیستم گریتینگ در اصل یک صفحه صیقلی است که تعداد زیادی خطوط نازک و موازی بر روی آن حک شده و کار منشور را به نحو بهتری انجام می دهد.


3) متمرکز کننده پرتو(Focusing device):
با ترکیبی از عدسی ها شکاف بین دو تیغه باریک فلزی و آیینه ها در مسیر پرتو تابش پرتوها مواز ی می شوند و با تنظیم عرض شکاف می توان عرض پرتو را تنظیم کرد. هر قدر عرض شکاف نور بکار رفته کمتر باشد کیفیت پرتوها بهتر خواهد بود.


4) محل نمونه:
کووتها(Cuvet) قسمتی از دستگاه هستند که نمونه مورد نظر یا بلانک در آن قرار می گیرد این بخش معمولا به صورت استوانه ای یا مستطیلی بوده از شیشه کوارتز یا پلاستیک ساخته شده است.
کووتهای پلاستیکی و شیشه ای برای محدوده مرئی بکار می روند.
به دلیل جذب پرتوهای با طول موج کمتر از 350نانومتر توسط کووتهای شیشه ای برای محدوده فرابنفش از کووتهای گرانقیمت کوارتزی یا سیلیسی استفاده می شود.


5) آشکارسازها(Detectors):
آشکارسازها دستگاههایی هستند که یک نوع از انرژی را به نوع دیگری تبدیل می کنند و معمولا به سه گروه اصلی تقسیم می شوند: 1- فتوالکتریکی 2- فتوشیمیایی 3- حرارتی. در دستگاههای اسپکتروفتومتر از آشکارسازهای فتوالکتریکی استفاده می شود. فتوسل و فتوتیوب از ساده ترین آشکارسازها می باشند.
فتوترانزیستورها و فتودیودها نیز برای این منظور استفاده می شوند. برای اندازه گیری نورهای ضعیف از PMT(Photomultiplier Tubes) بهره گرفته می شود. PMTها سریعتر جواب می دهند وعلاوه بر حساسیت بالا با دوام تر از سایر آشکارسازها می باشند.


6) دستگاه نمایش خروجی
این قسمت می تواند یک گالوانومتر صفحه ثبات اسیلوسکوپ یا صفحه نمایشگر کامپیوتر با نرم افزارهای متنوع باشد.




اتوآنالایزرها(Autoanalyzers):


آنالیزرهای بیوشیمیایی دستگاههایی هستند که غلظت متابولیتها، الکترولیتها، پروتئینها و داروها را در سرم، پلاسما، ادرار و سایر مایعات بدن با دقت و صحت زیادی اندازه گیری می کنند.
اصطلاح اتوماسیون(Automation) در بیوشیمی بالینی به فرایندی اطلاق می شود که یک دستگاه تعداد زیادی از تست ها را با دخالت اندک تکنسین یا کارشناس انجام می دهد. انجمن بین المللی شیمی محض و کاربردی(IUPAC) اتوماسیون را به صورت جایگزینی تلاش ها و فعالیت های انسان در انجام یک فرایند با وسایل و ابزار مکانیکی که دارای خصوصیات خود تنظیمی باشند تعریف می کند.


ساختار آنالیزر(Analyzer Configuration):
یک وسیله خودکار که توسط سازنده آن به صورت یکپارچه(Integrated) یا قسمت قسمت(modular) ساخته می شود. سیستمهای یکپارچه به صورت باز(open) و بسته(closed) هستند. در سیستمهای باز تکنسین میتواند پارامترهای تست را تغییر داده و محلولهای مورد نیاز را از هر فروشنده ای خریداری کند.


در سیستمهای بسته پارامترهای تست توسط سازنده برنامه ریزی شده وقابل تغییر نیستند بعلاوه محلولهای مورد نیاز هم خاص دستگاه هستند و باید از یک منبع واحد تهیه شوند.
در سیستمهای چند قسمتی یک آنالایزر خودکار توسط سازنده یا توسط خریدار سر هم می شود مزیت اینکار انعطاف پذیری و گسترده بودن تواناییهای آنالایزر در برآوردن نیازهای مختلف مصرف کننده می باشد. ISE یکی از مدولها اصلی است که به آنالایزرهای مختلف متصل می شود.