بیوتکنولوژی در ابزی پروری

[majid.izadi]

مقدمه
انجماد بلند مدت تكنيكي است كه بواسطه ي آن مي توان سلول هاي زنده ، بافت ها ، اندام ها ، رويان، لارو و ... را در دماي خيلي پايين (معمولا در 196- در جه سانتيگراد ) براي يك دوره ي زماني نامشخص ، نگهداري نمود. از اين تكنيك براي نگهداري و ايجاد بانك اسپرم به منظور تكثير مصنوعي در حيوانات پرورشي استفاده شده است. در بين ماهيان نيز كارهاي پژوهشي بسيار زيادي براي انجماد اسپرم و تخمك انجام پذيرفته است.تا به امروز اسپرم قريب به 200گونه ي ماهي به روش نگهداري در سرما، مورد سنجش قرار گرفته است .در شرايط دمايي صفر درجه سانتيگراد ، اسپرم را مي توان از چند ساعت تا چند روز ، بسته به نوع گونه ي مورد آزمايش ، نگهداري نمود. با توجه به يافته هاي تئوريك ، با استفاده از تكنيك نگهداري در سرما، سلول هاي جنسي را مي توان از 200 تا 32000 سال ، بدون كاهش در كيفيت آنها نگهداري نمود ( suquet و همكاران، 2000) .با وجود انجماد اسپرم در بين گونه هاي مختلف ماهي ، تا به امروز در انجماد تجاري تخم ماهي هنوز موفقيت چنداني حاصل نشده است. اندازه ي بزرگ، ساختار پيچيده، وجود چندين غشاء با نفوذپذيري متفاوت از موانع اصلي در انجماد تخم ماهيان مي باشد.​

​

​

 

[majid.izadi]

مزایای انجماد اسپرم ماهی​

1- هم زمان سازي قابليت دسترسي به هر دو جنس
براي تكثير دو نژاد بهاره يا پاييزه يك ماهي كه امكان دسترسي به هر دو جنس در يك زمان وجود ندارد، مي توان از اين روش بهره برد (Blaxter،1953).

2- استفاده از كل حجم مني موجود
براي گونه هايي كه بدست آوردن اسپرم از آنها مشكل مي باشد، مي توان از اين تكنيك استفاده كرد(مانند مارماهي ژاپني )(Ohta و Izawa،1996).همچنين براي استحصال اسپرم از گونه هايي كه در شرايط اسارت اسپرم كافي توليد نمي كنند نيز مي توان از اين روش بهره برد(مانند فلاندر دم زرد)(Clearwter و Crim، 1995).

3- آسان نمودن نگهداري مولدين
القاء تخم ريزي خارج از فصل توليدمثل در بسياري از گونه هاي ماهي پرورشي از طريق دستكاري دوره ي نوري و دمايي قابل اجراست(Bromage، 1995) ولي اين كار پر هزينه خواهد بود(Suquet و همكاران، 2000).زمانيكه اسپرم هاي منجمد شده در تمام سال وجود داشته باشد، دستكاري فصل تكثير تنها به ماهيهاي مولد ماده محدود مي گردد.

4- حمل ونقل آسان سلول هاي جنسي
در زماني كه سلول هاي جنسي مولدين را در محل هاي مختلف جمع آوري مي كنند، با اين روش جا به جايي آنها راحت تر انجام مي گيردعلاوه بر اين از اين روش براي معرفي ژن هاي مختلف از محيط طبيعي به ذخاير پرورشي نيز مي توان استفاده كرد.

5- جلوگيري از كاهش كيفيت اسپرم
كاهش كيفيت اسپرم در طول فصل توليدمثل در بسياري از گونه هاي ماهي گزارش شده است(Rana،1995). تكنيك انجماد اسپرم امكان جمع آوري اسپرم در زماني كه بالاترين كيفيت را دارا هستند،را فراهم مي كند.

6- حفاظت از تغييرپذيري ژنتيكي جمعيت هاي بومي
استفاده از تعداد محدودي از مولدين در كارگاه هاي تكثير، كاهش هتروزيگوسيتي را در پي خواهد داشت. اسپرم هاي منجمد شده از نژادهاي بهگزيني شده را مي توان به ذخايرگونه هاي پرورشي معرفي نمود.همچنين از بانك ژني موجود در اسپرم هاي منجمد شده مي توان براي حفظ تنوع ژنتيكي جمعيت ماهيهاي در معرض خطر و جلوگيري از آميزش خويشاوندي استفاده كرد.


علاوه بر موارد ذكر شده، در ماهيهاي هرمافروديت پروتوژينوس(مانند هامور)، امكان بدست آوردن اسپرم تنها در سنين 5 تا 10 سالگي وجود دارد از اين رو براي تكثير مصنوعي اين ماهيان داشتن ذخاير اسپرمي بسيار مفيد و حتي ضروري مي باشد(Suquet و همكاران، 2000).
از سال 1953 كه بلاكستر براي اولين بار عمل انجماد اسپرم را بر روي ماهي هرينگ به انجام رساند تا به امروز اين عمل بر روي تعداد زيادي از ماهيهاي آب شيرين و آب شور (بيش از 200 گونه) مورد آزمايش قرار گرفته است. محققين كشور نيز توانسته اند با موفقيت اسپرم ماهيان خاوياري(عابدي، 1375)، ماهي كپور (برادران نويري، 1377)، ماهي سفيد درياي مازندران(قاسمي، 1377) و قزل آلاي رنگين كمان (شكيبي دريا كناري،1380) را در شرايط سرمايي ذخيره سازي نمايند.​

 

[majid.izadi]

مراحل مختلف انجماد اسپرم​

فرآيند انجماد اسپرم را مي توان به چهار مرحله ي زير تقسيم بندي نمود:

1-مرحله ي قبل از انجماد(جمع آوري اسپرم)
عمل جمع آوري اسپرم در طول فصل توليدمثل مولدين صورت مي پذيرد.اسپرم هاي استحصال شده از مولدين به لوله هاي سرد شده توسط يخ انتقال داده مي شود. عدم آلودگي اسپرم به ادرار،مدفوع موكوس، خون و موادي از اين دست ضروريست.اسپرم هاي جمع آوري شده براي ادامه ي مراحل انجماد در يخچال نگهداري شده و قبل از آغاز مراحل بعدي ، كيفيت اسپرم مورد بررسي قرار مي گيرد. اختلاف كيفيت اسپرم در بين گونه هاي مختلف به تناوب در تحقيقات مختلف گزارش شده است(Rana،1995). دليل اين اختلافات، تفاوت ژنتيكي، محل نمونه برداري اسپرم(از داخل بيضه يا از طريق منفذ تناسلي)، آلودگي اسپرم هاي نمونه گيري شده با ادرار و زمان برداشت اسپرم در طول فصل توليدمثل بيان شده است(Suquet و همكاران، 2000) .

درآزاد ماهيان(Morisawa،1988) و در توربوت (Suquet و همكاران، 2000) برداشت اسپرم از منفذ تناسلي از طريق فشار به شكم ماهي در مقايسه با روش نمونه برداري از بيضه ، اسپرماتوزوئيدها تحرك بيشتري از خود نشان مي دهند. در مارماهي ژاپني، اسپرم هايي كه از داخل بيضه برداشت گرديدند بعد از فعال سازي در مقايسه با روش استحصال دستي تحرك كمتري داشتند(Ikedo و همكاران،1997).اسپرم هاي برداشت شده از بيضه بعد از اينكه در محلول نمكي با غلظت بالاي پتاسيم(K+) و بي كربنات(-Hco3) درمان گرديدند بطور مصنوعي تحرك طبيعي پيدا نموده و قابليت لقاح مشابه با روش ديگر داشتند(Ohata، و همكاران،1997).
به خاطر مجاورت لوله هاي اسپرم و لوله هاي ادراري، احتمال آلودگي نمونه هاي اسپرم با ادرار وجود دارد. اين پديده در گونه هاي آب شيرين گزارش گرديده (Rana،1995) اما بندرت در بين گونه هاي دريايي ديده شده است(Suquet و همكاران، 2000).آلودگي ادرار با اسپرم سبب كاهش درصد تحرك ، كاهش سرعت، نزول قابليت لقاح و كاهش قابليت نگهداري و ذخيره سازي اسپرم مي شود. غلظت ادرار و زمان نگهداري اسپرم بر تاثيرات ذكر شده مي افزايد. خالي نمودن ميزناي كليه قبل از عمل جمع آوري اسپرم ، به ميزان 3/9 درصد از آلودگي اسپرم به ادرا مي كاهد(Suquet و همكاران، 2000).

در گونه هايي كه داراي اسپرم متراكم هستند (مانند سي باس)، به خاطر ويسكوزيته ي پايين و تغيير رنگ قسمتي از اسپرم كه با ادرار آلوده گرديده، آلودگي اسپرم به ادرار به آساني قابل تشخيص مي باشد(Fauvel و همكاران،1999).
در بسياري از گونه ها غلظت اسپرم با رسيدن به انتهاي فصل تكثير كاهش مي يابد(Fauvel و همكاران،1999).اسپرم اين گونه ها در ابتداي فصل توليدمثل در مقايسه با انتهاي آن داراي مدت تحرك بيشتري مي باشد(Billard و همكاران،1999). بنابراين، ميزان تحرك پايين، ميزان لقاح كم و كاهش قابليت نگهداري كوتاه مدتِ اسپرم در انتهاي فصل تكثير گزارش شده است(Suquet و همكاران، 2000). ​

توجه به نكات زير در هنگام جمع آوري اسپرم از مولدين براي حفظ كيفيت اسپرم به منظور انجماد و ذخيره سازي آنها ضروري مي باشد:​

1- جمع آوري اسپرم بدون هيچ آلودگي به ادرار، مدفوع، خون يا فلس؛
2- نگهداري اسپرم جمع آوري شده در بهترين شرايط با فراهم نمودن هوا يا اكسيژن براي تنفس در طول انجام عمل استحصال اسپرم؛
3- نگهداري دماي اسپرم جمع آوري شده در 4 درجه ي سانتيگراد در طول جمع آوري و انتقال در محيط كار.
البته اسپرم هاي جمع آوري شده از هامور مالاباري مرده كه در دماي 4 درجه ي سانتيگراد نگهداري شده بود، براي چندين ساعت كيفيت خود را حفظ نمود(Chao و همكاران،2000).​

 

[majid.izadi]

2-انجماد​

قبل از آغاز فرآيند انجماد نياز به تهيه ي محلول رقيق كننده و محافظت كننده مي باشد.

2-1- رقيق كننده
رقيق كننده ها محلول نمكي مي باشند كه براي رقيق سازي اسپرم استفاده مي شود. شايان ذكر است كه اسپرم رقيق نشده غير قابل انجماد مي باشد(Thomas،2003). علاوه بر وظيفه ي رقيق سازي اسپرم، جلوگيري از فعال شدن اسپرم و فراهم كردن محيطي براي اضافه نمودن محافظت كننده ها از ديگر كاربردهاي اين محلول مي باشد.
بيشترين رقيق كننده هاي مورد استفاده در انجماد اسپرم در ماهيهاي دريايي محلول نمكي (با غلظت 1-10 درصد) يا شكر (با غلظت 5-10 درصد) مي باشد(Suquet و همكاران، 2000). از آنجايي كه تحرك اسپرم وابسته به ذخاير ATP مي باشد، محلول رقيق كننده بايد از حركت اسپرم قبل از انجماد جلوگيري كند. با اين وجود در توربوت به عنوان يك گونه ي دريايي ، اضافه نمودن محافظت كننده از قبيل دي متيل سولفوكسيد با افزايش اسمولاليته به ميزان 1100 ميلي اسمول با ازاء هر كيلوگرم سبب القاء حركت اسپرم به مدت كمتر از يك دقيقه مي شود. اين فعاليت اسپرم قبل از انجماد تاثيري بر قابليت لقاح و تحرك آنها ندارد كه احتمالا به خاطر پديده ي سنتز دوباره ي ATP در طول فعاليت اسپرم در اين ماهي مي باشد(Dreanno و همكاران، 1997).
محلول رقيق كننده ي مونايب (ساكارز، بي كربنات پتاسيم، گلوتاتيئون و زرده ي تخم مرغ) براي انجماد اسپرم ماهيهاي دريايي، روغن ماهي، سي باس، توربوت و بسياري از ماهيهاي آب شيرين مناسب تشخيص داده شده است. وجود گلوتاتيئون در اين محلول از اثر تخريبي راديكال هاي آزاد(Maracine و Segner ، 1997) و پراكسيد شدن چربي ها جلوگيري كرده و از غشاء اسپرمي محافظت مي كند(Baulny، 1997).
در ايران انجماد و نگهداري اسپرم ماهي قزل آلاي رنگين كمان نشان داده كه با استفاده از رقيق كننده و محافظت كننده ي با تركيب تريس، زرده تخم مرغ، گلوكز و دي متيل سولفوكسيد بهترين نتايج حاصل مي گردد(شكيبي دريا كناري، 1380). اسپرم ماهي سفيد نيز با استفاده از تكنيك انجماد اسپرم مورد بررسي قرار گرفت. نتايج اين تحقيق نشان داد كه رقيق كننده ي Kurokura ، با تركيب كلريد كلسيم، كربنات سديم، كلريد منيزيم، كلريد پتاسيم، كلريد و آب مقطر بهترين محلول رقيق كننده براي انجماد اسپرم اين ماهي مي باشد(قاسمي،1377).
نسبت رقت اسپرم در رقيق كننده ها از 1 :1 تا 20:1 (حجم مايع مني به حجم رقيق كننده) متغير مي باشد.براي كفال مخطط و تيلاپيا نسبت 1:1 ، براي خامه ماهي 4:1 ، براي هامور 20:1 (Chao و Liao، 2001) ، براي قزل آلاي رنگين كمان 1: 3 (قاسمي،1377) گزارش گرديده است. در ماهي هامور در زمانيكه ميزان رقت مني از 10:1 به 100:1 تنزل پيدا كرد مدت زمان تحرك اسپرم از 40 دقيقه به 2 دقيقه كاهش يافت(Gwo، 1993).
دليل علمي كه مي توان براي تفسير اين نتيجه ارائه نمود اينست كه پروتئين پلاسماي مني از قابليت بازماندگي و بقاء اسپرم حفاظت مي نمايد وكاهش رقت اسپرم به بيش از 10:1 باعث كاهش تاثير پروتئين پلاسماي مني و كاهش كيفيت اسپرم مي گردد(Billard،1983).


2-2- محافظت كننده ها
اين مواد شيميايي ، آسيب هاي ناشي از انجماد (تشكيل بلورهاي يخ)، بر روي سلول هاي جنسي، را به حداقل مي رساند.اين مواد شيميايي سرعت انتشار آب ازداخل سلول به خارج سلول راكاهش داده و از سرعت رشد كريستال هاي يخي مي كاهد.براي انتخاب يك محافظت كننده ي مناسب بايد به نكات زير توجه نمود:
الف- موادانتخابي بايد ميزان سميت پاييني داشته باشند؛
ب‌- قابل حل در آب باشند؛
ج‌- قابليت نفوذ به داخل سلول را دارا باشند.
معمولا محافظت كننده ها را به دو گروه نفوذ پذير و نفوذناپذير تقسيم مي كنند.اتيلن، پروفيلن گليكول، گليسرول، دي متيل سولفوكسيد و متانول جزء محافظت كننده هاي نفوذ پذير مي باشند. از جمله دلايل استفاده از اين نوع محافظت كننده ها سرعت نفوذ آنها به داخل اسپرم و واكنش بين آنها با فسفوليپيدهاي غشاء اسپرم بيان شده است(Baulny،1997). دي متيل سولفوكسيد رايج ترين محافظت كننده مورد استفاده در انجماد اسپرم ماهي مي باشد كه قابليت نفوذ پذيري آن متاثر از دما نيست و ميزان سميت آن بين گليسرول كه حداقل سميت و متانول كه بيشترين سميت را داراست ، قرار دارد(Thomas،2003). البته غلظت بالا دي متيل سولفوكسيد ((DMSO سمي بوده و مدت تحرك اسپرم برخي از گونه ها در غلظت بالاي اين ماده كاهش يافته است(Leung،1987؛ Gwo،1993). دي متيل سولفوكسيد، گليسرول، مخلوط دي متيل سولفوكسيد و گليسرول، پروپان اديول، دي متيل استامين و پلي اتيلن گليكول براي انجماد اسپرم آزاد ماهيان مورد استفاده قرار گرفت كه در اين ميان مخلوط 5 درصد دي متيل سولفوكسيد و يك درصد گليسرول مؤثرترين محافظت كننده گزارش گرديد(Lahnsteiner، و همكاران،1996).در آزاد ماهيان متانول تاثير معني دار در انجماد اسپرم هايي دارد كه نسبت اسپرم به تخم در هنگام لقاح پايين باشد(Lahnsteiner، و همكاران،1997).با وجود اين، متانول در انجماد اسپرم ماهيهاي دريايي بي تاثير بوده و يا اثر اندكي دارد(Suquet و همكاران، 2000).
در ماهيهاي آب شيرين محافظت كننده هاي نفوذناپذير ازقبيل پروتئين ها(BSA) يا ليپوپروتئين ها (زرده ي تخم مرغ)، ساكارز و گلوكز براي جلوگيري از وارد شدن آسيب به غشاء پلاسمايي رايج مي باشد(Scott و Baynes، 1980). اين مواد سبب افزايش مقاومت غشاء در برابر استرس هاي اسمزي و افزايش تحرك اسپرم ماهي قزل آلا رنگين كمان بعد از انجماد زدايي مي شود(Rana و همكاران، 1998).


2-3- ايجاد تعادل بين اسپرم و محلول رقيق كننده
مخلوط اسپرم و محلول رقيق كننده به منظور ايجاد توازن بين تركيبات محلول و سلول، براي مدت كوتاهي در دماي پايين نگهداري مي شوند. اين زمان بسته به نوع ماده ي محافظت كننده ي انتخابي متغير مي باشد. در مواردي كه از مواد نفوذپذير مانند گليسرول استفاده مي شود، به زمان بيشتري نياز خواهد بود.با تمام اين اوصاف اين زمان نبايد بيش از يك ساعت باشد. در غير اين صورت احتمال فعال شدن اسپرم ها در محلول رقيق كننده وجود دارد.افزايش زمان موازنه از 5 دقيقه به 60 دقيقه و افزايش غلظت DMSO از 10 به 30 درصد در ماهي سي باس ، سبب كاهش تحرك اسپرم بعد از خروج از حالت انجماد شده است(Gwo،1994). چنين اثري بعد از يك ساعت در كفال مخطط نيز ديده شده است(Chao و همكاران،1975). در مورد قزل آلاي رنگين كمان، براي نفوذ DMSO به داخل سلول 10 دقيقه زمان نياز است. اين مدت تاثيري بر روي كيفيت اسپرم ها نخواهد گذاشت(Suquet و همكاران، 2000). مخلوط گليسرول و DMSO به دليل سرعت نفوذ پايين گليسرول به مدت زمان بيشتري براي نفوذ به داخل سلول نياز خواهد داشت.


2-4- مرحله ي انجماد
معمولا از سه روش براي انجماد اسپرم استفاده مي شود(Thomas،2003):
1- روش پلت هاي يخي: اين روش براي انجماد اسپرم آزاد ماهيان بطور وسيع مورد استفاده قرار گرفته است. اندازه ي پلت ها ممكن است بين 20 تا 200 ميلي ليتر متغير باشد. سرعت انجماد اسپرم در اين روش 20 – 35 درجه سانتيگراد در هر دقيقه مي باشد. مخلوط اسپرم و محلول رقيق كننده را به حفره ي هاي كوچكي كه در يخ خشك تعبيه مي شود، انتقال مي دهند(دماي انجماد 79- درجه سانتيگراد). گلوله هاي يخ ايجاد شده به اين روش براي ذخيره سازي و نگهداري طولاني به نيتروژن مايع انتقال داده مي شود. در اين روش نيازي به نگهداري اسپرم در محلول رقيق كننده براي ايجاد تعادل و نفوذ محافظت كننده به داخل سلول نيست و مي توان بلافاصله اين مخلوط را منجمد نمود.
2- روش استفاده ي از لوله هاي باريك
لوله هاي باريك (استرو) در حجم هاي مختلف (25/0 تا 4 ميلي ليتر) براي انجماد اسپرم مورد استفاده قرار مي گيرد.اين روش به دليل حفظ كيفيت اسپرم پس از انجماد زدايي و كاهش فرصت كريستاليزه شدن دوباره ي اسپرم در طول انجماد زدايي ، در سال هاي اخير رواج بيشتر ي پيدا نموده است.بعد از انتقال مخلوط اسپرم و محلول رقيق كننده به اين لوله ها، ابتدا در بخار نيتروژن مايع و يا يخ خشك سرد شده و در ادامه به نيتروژن مايع انتقال داده مي شود. سرعت انجماد در اين روش در بين ماهيهاي آب شيرين 20 تا 160 درجه سانتيگراد در هر دقيقه و براي ماهيهاي آب شور بين 5 تا 150 درجه سانتيگراد در هر دقيقه گزارش شده است(Thomas و همكاران، 2003).
3- روش استفاده از ويال يا سرنگ
برخي از محقيقين از اين وسايل نيز براي ذخيره سازي و نگهداري اسپرم رقيق شده ي ماهيان استفاده نموده اند(Mounib،1978،براي ماهي آزاد اقيانوس اطلس و روغن ماهي ؛ Gupta و همكاران براي كپور).


2-5- مرحله ي ذخيره سازي
اسپرم هاي منجمد شده در مرحله ي قبلي را مي توان در دماي 196- درجه سانتيگراد در نيتروژن مايع براي مدت طولاني نگهداري نمود.​

 

[majid.izadi]

3- ذوب اسپرم هاي منجمد شده​

براي جلوگيري از تشكيل دوباره ي بلورهاي يخ در سلولها ي جنسي در حين انجماد زدايي، ذوب سريع اسپرم هاي منجمد شده ضروريست. سرعت ذوب اسپرم در ماهيهاي دريايي پايين تر از ماهيهاي آب شيرين مي باشد( براي ماهيهاي آب شيرين 30-80 درجه ي سانتيگراد در هر دقيقه (Rana، 1995) و براي ماهيهاي دريايي از 1 تا 40 درجه ي سانتيگراد در هر دقيقه(Sequet و همكاران،2000) گزارش شده است). بطور معمول ظروف حاوي اسپرم در حمام آب گرم و پلت هاي يخي اسپرم مستقيما در محلول لقاح ذوب مي شوند(Lahnsteiner،2000). محلول لقاح مورد نياز براي ذوب پلت هاي اسپرمي آزاد ماهيان از كربنات سديم يك درصد و نمك طعام تشكيل مي شود(Thomas و همكاران، 2003). يك پلت به 1-2 ميلي ليتر محلول لقاح كه داري دماي 25-30 درجه سانتيگراد مي باشد، انتقال داده مي شود. بعد از 5-10 ثانيه اسپرم هاي منجمد شده، ذوب شده و مستقيما براي لقاح تخمك ها مورد استفاده قرار مي گيرند. كمترين تراكم اسپرم مورد نياز براي لقاح مناسب تخمك ها 106×3 اسپرم به ازاء تخمك گزارش گرديده است(Thomas و همكاران، 2003). لوله ي باريك حاوي اسپرم هاي منجمد شده نيز در حمام آب گرم با دماي 30-40 درجه سانتيگراد قرار داده مي شوند. از ميكروويو نيز براي ذوب لوله هاي باريك حاوي اسپرم هاي منجمد ماهي هامور استفاده شده كه نتايج خوبي از آن بدست آمده است. ويال هاي حاوي اسپرم منجمد نيز به 65-70 ثانيه زمان نياز دارند تا اسپرم ها به حالت اوليه برگردند. محاسبات نشان مي دهد كه ويال حاوي 3 ميلي ليتر اسپرم براي لقاح 100 الي 150 هزار تخمك كفايت مي كند(Thomas و همكاران، 2003).

ذوب اسپرم هاي منجمد شده از مهم ترين مراحل فرآيند انجماد اسپرم مي باشد و تخطي از شرايط نرمال و اپتيمال باعث كاهش معني دار درصد لقاح تخم مي شود. به عنوان مثال اگر زمان انجماد زدايي براي 5 ثانيه و يا دماي مورد نياز براي ذوب اسپرم آزاد ماهيان و اردك ماهي 5 درجه سانتيگراد تغيير كند، ميزان باروري اين اسپرم ها به طور معني داري كاهش مي يابد(Lahnsteiner،2000).
بعد از اينكه اسپرم ها از حالت انجماد خارج شدند، بايد بلافاصله مورد استفاده قرار گيرند. در ماهي توربوت يك ساعت بعد از انجماد زدايي از اسپرم، با وجود نگهداري آنها بر روي خرده هاي يخ، ميزان تحرك اسپرم 35 درصد كاهش يافت(Dreanno و همكاران، 1997). البته شايان ذكر است كه قرار دادن اسپر م هاي ذوب شده در داخل مايعي شبيه به مايع مني، قابليت نگهداري كوتاه مدت اسپرم را افزايش مي دهد(Sequet و همكاران،2000).

قبل از استفاده ي از اسپرم هاي ذوب شده بايد به نكات زير توجه شود:
1- تعيين تحرك اسپرم به عنوان راهنمايي براي برآورد موفقيت لقاح؛
2- كاهش زمان بين ذوب كردن اسپرم هاي منجمد شده و انجام عمل لقاح؛
نسبت رقت اسپرم: از آنجايي درصد موفقيت لقاح در ارتباط با غلظت اسپرم مي باشد و از طرف ديگر تمام اسپرم هاي منجمد شده در طول فرآيند انجماد كيفيت خود را حفظ نمي كنند، لذا لازم است كه در هنگام انجام عمل لقاح ميزان تراكم اسپرم هاي ذوب شده بالاتر از اسپرم هاي تازه باشد.​

منبع:سيد مرتضي ابراهيم زاده
دانش آموخته ي دانشگاه تربيت مدرس-مقطع كارشناسي ارشد.


منابع1- کلباسی، محمدرضا،جزوه ی درسی تکثیر و پرورش تکمیلی آبزیان، دوره ی کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس،1382.
2-کیوان شکوه، سعید، مروری بر عملکرد پژوهشی دانشگاه ها و مراکز تحقیقات علوم شیلاتی در زمینه ژنتیک آبزیان در ایران، سمینار کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده ی علوم دریایی نور، 1380.
3- Babiak, I., Glogowski, J., Brzuska, E., Szumiec, J., Adamek, J.,
Cryopreservation of sperm of common carp, Cyprinus carpio L. Aquac.
Res. 28, 567–571, 1997.
4- Blaxter, J.H.S., Sperm storage and cross fertilization of spring and autumn spawning herring. Nature 172:1189-1190, 1953.
5-Holtz, W., cryopreservation of rainbow trout sperm: practical recommendations. Aquaculture, 110:97-100, 1993.
6-Lanhnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R.A., Methanol as cdyoprotectant and the suitability of 1/2 ml and 5 ml straw for cryopreservation of semen from salmonid fishes, Aquaculture Research, 28, 471-479,1997.
7- Lanhnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R.A., A uniform method for cryopreservation of semen of the salmonid fishes Oncorhynchus mykiss, Salmo trutta fario, Salmo trutta, Coregonus sp., Aquaculture Research, 26:801-807,1995.
8- Mounib, M. S., Cryogenic preservation of fish and mammalian spermatozoa.J.Repord. Fertil.53:13-18, 1978.
9-Rana, K. 1995. Preservation of gametes in Broodstock Management and Egg and Larval Quality. N. R. Bromage and R. J. Roberts, editors. University Press, Cambridge, England. Pp. 53–75.
10- Suquet, M., Dreanno, C., Fauvel, C., Cosson, J., Billard, R., Cryopreservation of sperm in marine fish. Aquaculture Research,31:231-243, 2000.
11-Thomas, P.C., Rath, S.C., Mohapatra, D.K. Breeding and seed production of Fin fish and Sellfish. Daya puplishing house. 2003
articles.ir