د
ر سال‌هاي اخير استفاده وسيعي از بيوسراميك‌هاي كلسيم فسفاتي ، از قبي ل هيدروكسي آپاتيت (HA) و تري كلسيم فسفات (TCP) در كاربردهاي بازسازي و ترميم استخوان ، صورت گرفته است. اين بيو سراميك‌هاي كلسيم فسفاتي داراي شباهت شيميايي و ساختاري با فاز معدني استخوان هستند و موجب تسريع رشد سلول‌هاي استخواني مي شوند. از بيوسراميك‌هاي زيست فعال ، در ارتوپدي براي ترميم نقايص استخوان و پوشش سطوح ايمپلنت‌هاي فلزي ، جهت بهبود يكپارچگي ايمپلنت ، استفاده مي‌شود. در عين حال اين مواد به خاطر تردي و شكنندگي ، جهت شكل دادن دچار مشكل بوده و نيز داراي نرخ تخريب كم و خواص مكانيكي
ضعيف هستند.
استفاده از كامپوزيت پليمر زيست تخريب پذير/ بيوسراميك ، مي تواند راه حلي براي حل اين مشكلات باشد. اضافه كردن پليمرهاي زيست تخريب پذير از قبيل پلي ال-لاكتيك اسيد (PLLA)، پلي گليكوليك اسيد (PGA) و كو پليمر پلي لاكتيك اسيد - پلي گليكوليك اسيد (PLGA) ، به سراميك‌هاي كلسيم فسفاتي ، امكان كنترل بهتر ساختارهاي ميكروسكوپي و ماكروسكوپي را در شكل دادن كامپوزيت‌ها براي بهبود عيوب استخواني ، فراهم مي آورد. به علاوه ، از پليمرهاي زيست تخريب پذير مي توان جهت كاهش شكنندگي سراميك‌ها ، استفاده كرد. كامپوزيت‌هاي پليمر زيست تخريب پذير/ بيوسراميك ، مواد اميد بخشي براي پيوند استخوان بوده و بسيار مورد توجه قرار گرفته است.
امروزه جهت ساخت داربست‌هاي كامپوزيت پليمر/ بيوسراميك جهت كاربرد در مهندسي بافت استخوان بيشتر از روش‌هاي (SC/PL) Solvent casting / Particulate leaching ، (GF/PL) Gas foaming / Particulate leaching و Phase Separation استفاده مي‌شود. ساخت داربست‌هاي كامپوزيت از روش SC/PL و Phase Separation با استفاده از حلال‌هاي آلي انجام مي پذيرد كه حلال‌هاي باقيمانده در داربست‌ها مي‌تواند براي سلول‌هاي پيوندي يا بافت‌هاي ميزبان ، مضر باشند.
استفاده از روش GF/PL ، براي ساخت داربست‌هاي كامپوزيت ، علاوه بر مستحكم بودن ، داراي قابليت هدايت استخوان بوده و همراه با نرخ تخريب كنترل شده است تا فضاي لازم براي تشكيل استخوان جديد را فراهم آورد.
نحوه ساخت داربست‌ها
داربست‌هاي كامپوزيت متخلخل PLGA/HA با استفاده از 2 روش GF/PL و SC/PL ساخته شدند و مورد مقايسه قرار گرفتند.
جهت ساخت داربست از روش GF/PL ، كامپوزيت هاي PLGA/HA با نسبت 25:75 ذرات ( PLGAقطر=200-100 ميكرومتر، وزن مولكولي Da =100000، پليمرهاي )Birmingham نانو ذرات ( HAقطر=تقريبا 100 نانومتر شركت بركلي) و ذرات سديم كلرايد ( قطر=200-100 ميكرومتر ) آماده شدند. ذرات پليمر با ذرات NaCl و HA مخلوط شدند. نسبت جرمي PLGA/HA/NaCl ، 9:1:1 بود. مخلوط مذكور داخل قالب‌هاي صفحه‌اي شكل به قطر 35/1 سانتيمتر ريخته و به مدت يك دقيقه با پرس Carver ، تحت فشار PSI 2000 ، قرار داده شد ؛ تا ضخامت 7/1 ميلي متر ، حاصل آيد. سپس ، نمونه ها در معرض فشار بالاي گاز 2PSI( CO800) به مدت 48 ساعت ، قرار داده شد ؛ تا پليمر با گاز ، اشباع شود. آنگاه با كاهش فشار گاز به فشار محيط ، يك پايداري ترموديناميك ، حاصل شد كه منجر به جوانه زني و رشد حفره هاي 2CO ، درون د
اربست گشت. ذرات NaCl از داربست‌ها با شستشو در آب مقطر به مدت 48 ساعت ، حذف شد. داربست‌هاي PLGA بدون HA نيز با روش GF/PL ، توليد شده و به عنوان نمونه شاهد مورد استفاده قرار گرفت .(GF/PL-No HA(
جهت ساخت داربست از روش SC/PL ، ابتدا PLGA در حلال متيلن كلرايد با 10 درصد غلظت (w/v)، حل شده و NaCl و HA به محلول PLGA در همان اندازه ها اضافه شدند. سپس اين مخلوط در استوانه‌هاي تفلوني به قطر 5/21ميلي متر و ارتفاع 25 ميلي متر ريخته شد. پس از تبخير حلال ، داربست‌هاي كامپوزيت از قالب‌ها بيرون آورده شد و نمك با قرار گرفتن داربست‌ها در آب مقطر به مدت 48 ساعت ، حذف شد و در نهايت داربست‌هاي متخلخل PLGA/HA از روش ساخت SC/PL حاصل آمد.
مشخصات داربست‌هاي PLGA/HA
ساخت داربست از روش GF/PL و سپس شستشو و حذف نمك ، در داربست‌هاي حاوي درصد بالاي ذرات نمك طعام ، منجر به تشكيل ساختارهاي متخلخل با تخلخل‌هاي باز ، مي‌شود. روش SC/PL ، منجر به ساخت داربست‌هايي با اندازه تخلخل 100-200 ميكرومتر مي شود. برعكس روش GF/PL ، منجر به ساخت داربست‌هايي با دوسطح از تخلخل مي‌شود. يكي ماكرو تخلخل هاي پيوندي (100-200 ميكرومتري) كه در اثر شستشو و حذف ذرات نمك طعام ، حاصل مي شود و نيز تخلخل‌هاي بسته و كوچك‌تر (10-45 ميكرومتري) كه دراثر جوانه زني و رشد حفره هاي گازي ، در داربست، ايجاد مي شوند (
شكل-2 قسمت .)B ميانگين تخلخل داربست‌هاي GF/PL و SC/PL به ترتيب%3ر91 و%3ر85 درصد است.
خواص مكانيكي داربست‌ها با استفاده از آزمون‌هاي فشار و كشش ، مورد ارزيابي قرار گرفت. داربست‌هاي GF/PL ، داراي خواص مكانيكي بهتري نسبت به داربست‌هاي SC/PL بودند. ميانگين مدول فشار ، براي داربست‌هاي SC/PL ôGF/PL به ترتيب MPa4/0+3/2 وMPa3/0+5/4 بود و ميانگين مدول كششي براي آن‌ها به ترتيب 1/0+0/2 و2/0+9/26 مگا پاسگال بود. اين داده ها ، بيانگر 99 % افزايش در مدول فشاري و %1331 افزايش در مدول كششي است كه نشان دهنده آثار مثبت فرايند توليد GF/PL ، در بهبود خواص مكانيكي داربست‌ها است.
براي تعيين اينكه آيا فرايند توليد داربست‌ها بر ميزان تماس HA با سطح داربست ، تاثير دارد يا خير ، HA را با ماده رنگي آبدوست ، مشخص كرديم و نشان داده شد كه اين تاثير در داربست‌هاي GF/PL بيش از داربست‌هاي SC/PL است (شكل 3 قسمت هاي .(A,C,D تركيب سطح داربست‌هاي كامپوزيت PLGA/HA را نيز به وسيله XPS ، بررسي كرديم. ميزان كلسيم در سطح داربست GF/PL بيش از سطح داربست SC/PL بود(شكل3 - قسمت .(G
كشت استئوبلاست‌ها روي داربست‌ها
علاوه بر كشت سلولي در آزمايشگاه ، داربست‌ها در بدن موجود زنده (موش آزمايشگاهي) نيز قرار گرفتند. هر دو داربست كامپوزيت PLGA/HA ، امكان چسبيدن و تكثير طي يك دوره 56 روزه كشت آزمايشگاهي را از خود نشان دادند. تراكم اوليه 106x2 سلول در هر داربست ، منجر به 106x33/1 سلول در هر داربست شد كه به داربست GF/PL پس از گذشت يك روز از كشت ، چسبيبده بود كه ميزان 5/66% را نشان مي دهد. براي داربست SC/PL ، كارايي مذكور 62 درصد بود. رشد سلول‌هاي استخواني (استئوبلاست‌ها) در داربست‌هاي GF/PL ، سريع‌تر از داربست‌هاي SC/PL بود (شكل4.) ميانگين دانسيته سلول داربست‌هاي GF/PL ، برابر106x48/2 سلول در هر داربست ، پس از گذشت 4 هفته از كشت بود ؛ درحالي‌كه براي داربست‌هاي SC/PL ، برابر 106x19/2 سلول در هر داربست بود ؛ يعني به ترتيب 5/86 % و 7/69% رشد را نشان دادند (شكل5.)
بررسي كاشت در بدن موجود زنده
كاش
ت هردو نوع داربست كامپوزيت PLGA/HA ، منجر به ايجاد و رشد سلول‌هاي استخواني جديد ، طي 5 و8 هفته ، در بدن موجود زنده (موش آزمايشگاهي) شد. 5 هفته پس از كاشت ، ميزان كمي سلول‌هاي استخواني ، هم در داربست‌هاي ( SC/PLشكل6 قسمت )A,B و هم در ( GF/PLشكل6 - قسمت )C,D مشاهده شده است.
8هفته پس از كاشت ، رشد سلول‌هاي استخواني افزايش يافت (شكل7 قسمت .)C,F تجزيه وتحليل بافت شناسي مقاطع مياني بافت‌ها ، نشانگر تشكيل سلول‌هاي استخواني بيشتر در داربست‌هاي GF/PL ، نسبت به داربست‌هاي SC/PL و داربست‌هاي PLGA بدون HA ، پس از گذشت 5 و 8 هفته از كاشت بود (شكل8 - قسمت .(A برعكس ، داربست‌هاي PLGA بدون HA ، هيچ سلول استخواني جد
يدي پس از 8 هفته، توليد نكردند. بيشتر حفره هاي داربست‌هاي PLGA بدون HA ، توسط بافت‌هاي پيوندي ، بدون ايجاد سلول‌هاي استخواني طي 5 و8 هفته پر شده بود (شكل7 - قسمت .(A,B
بحث و نتيجه‌گيري
دو روش (SC/PL) Solvent casting / Particulate leaching ، (GF/PL) Gas foaming / Particulateleaching ، جهت ساخت داربست‌هاي كامپوزيتي بيوسراميك/ پليمري ، جهت مهندسي بافت استخوان ، مورد بررسي قرار گرفت. داربست‌هاي PLGA/HA كه توسط روش GF/PL ساخته شدند، باعث تماس بالاي HA روي سطح داربست شده و ايجاد و رشد سلول‌هاي استخواني در آن‌ها ، نسبت به روش SC/PL ، بهتر بود. در مقايسه با ساير روش‌هاي ساخت داربست‌هاي كامپوزيتي پليمري/ سراميكي ، روش GF/PL داراي مزاياي زيادي است كه در ادامه بيان مي‌شود :
1) در فرايند GF/PL ، استفاده ازحلال‌هاي آلي لازم نيست. حلال‌هاي آلي باقيمانده در داربست‌ها ، منجر به آسيب سلول‌ها و بافت‌هاي مجاور مي‌شوند. به علاوه ، تماس حلال‌هاي آلي ، مي تواند مانع فعاليت عوامل فعال بيولوژيك شود.
2) روش GF/PL مي تواند به طور مؤثري بيو‌سراميك‌ها را در تماس با سطح داربست‌هاي كامپوزيت پليمري/ بيوسراميكي قراردهد. اين موضوع را مي توان با آناليز XPS و استفاده از مواد رنگي آبدوست ، بررسي كرد. روش SC/PL ، منجر به پوشش داده شدن پليمر ، روي بيو‌سراميك‌ها مي‌شود كه اين امر موجب مي شود كه بيو سراميك‌ها ، تماسي با سطوح داربست ، پيدا نكنند ؛ درحالي‌كه در روش GF/PL كه از محلول پليمري استفاده نمي‌شود ، اين تماس ، بسيار خوب برقرار مي‌شود. بنابراين داربست GF/PL ، تماس سلول‌هاي استخواني را با سراميك‌هاي زيست فعال كه باعث رشد سلول‌هاي استخواني مي شود ، بيشتر مي كند.
3) داربست‌هاي GF/PL ، خواص مكانيكي بهتري نسبت به داربست‌هاي SC/PL ، دارا هستند.
داربست‌هاي GF/PL ، داراي مدول‌هاي فشاري و كششي بسيار بالاتري هستند كه مي تواند ناشي از دانسيته بيشتر و زنجيره هاي پليمري تحت فشار باشد. به علاوه ، حلال باقيمانده در داربست‌هاي SC/PL مي تواند به عنوان عامل داكتيل شدن پليمر ، عمل كند.
استفاده از داربست‌هاي GF/PL ، منجر به بهبود پتانسيل سلول‌هاي استخواني مي‌شود. چون داربست‌هاي SC/PL و GF/PL ، داراي خواص فيزيكي مشابهي از نظر اندازه تخلخل و به هم پيوستگي تخلخل‌ها هستند، تفاوت در ميزان ايجاد و رشد سلول هاي استخواني در آن‌ها مي تواند ناشي تماس مستقيم سلول‌ها با ذرات HA روي سطح داربست باشد كه تكثير و رشد سلول‌هاي استخواني را تحريك مي كند. برعكس ذرات HA در داربست‌هاي SC/PL ، توسط پليمر پوشش داده مي شوند و تماسي با سلول ندارند و تخريب PLGA نياز به زمان طولاني داشته و هيچ شتابي در ساخت سلول‌هاي استخواني توسط HA ، ديده نمي‌شود.
ضعيف هستند.
استفاده از كامپوزيت پليمر زيست تخريب پذير/ بيوسراميك ، مي تواند راه حلي براي حل اين مشكلات باشد. اضافه كردن پليمرهاي زيست تخريب پذير از قبيل پلي ال-لاكتيك اسيد (PLLA)، پلي گليكوليك اسيد (PGA) و كو پليمر پلي لاكتيك اسيد - پلي گليكوليك اسيد (PLGA) ، به سراميك‌هاي كلسيم فسفاتي ، امكان كنترل بهتر ساختارهاي ميكروسكوپي و ماكروسكوپي را در شكل دادن كامپوزيت‌ها براي بهبود عيوب استخواني ، فراهم مي آورد. به علاوه ، از پليمرهاي زيست تخريب پذير مي توان جهت كاهش شكنندگي سراميك‌ها ، استفاده كرد. كامپوزيت‌هاي پليمر زيست تخريب پذير/ بيوسراميك ، مواد اميد بخشي براي پيوند استخوان بوده و بسيار مورد توجه قرار گرفته است.
امروزه جهت ساخت داربست‌هاي كامپوزيت پليمر/ بيوسراميك جهت كاربرد در مهندسي بافت استخوان بيشتر از روش‌هاي (SC/PL) Solvent casting / Particulate leaching ، (GF/PL) Gas foaming / Particulate leaching و Phase Separation استفاده مي‌شود. ساخت داربست‌هاي كامپوزيت از روش SC/PL و Phase Separation با استفاده از حلال‌هاي آلي انجام مي پذيرد كه حلال‌هاي باقيمانده در داربست‌ها مي‌تواند براي سلول‌هاي پيوندي يا بافت‌هاي ميزبان ، مضر باشند.
استفاده از روش GF/PL ، براي ساخت داربست‌هاي كامپوزيت ، علاوه بر مستحكم بودن ، داراي قابليت هدايت استخوان بوده و همراه با نرخ تخريب كنترل شده است تا فضاي لازم براي تشكيل استخوان جديد را فراهم آورد.
نحوه ساخت داربست‌ها
داربست‌هاي كامپوزيت متخلخل PLGA/HA با استفاده از 2 روش GF/PL و SC/PL ساخته شدند و مورد مقايسه قرار گرفتند.
جهت ساخت داربست از روش GF/PL ، كامپوزيت هاي PLGA/HA با نسبت 25:75 ذرات ( PLGAقطر=200-100 ميكرومتر، وزن مولكولي Da =100000، پليمرهاي )Birmingham نانو ذرات ( HAقطر=تقريبا 100 نانومتر شركت بركلي) و ذرات سديم كلرايد ( قطر=200-100 ميكرومتر ) آماده شدند. ذرات پليمر با ذرات NaCl و HA مخلوط شدند. نسبت جرمي PLGA/HA/NaCl ، 9:1:1 بود. مخلوط مذكور داخل قالب‌هاي صفحه‌اي شكل به قطر 35/1 سانتيمتر ريخته و به مدت يك دقيقه با پرس Carver ، تحت فشار PSI 2000 ، قرار داده شد ؛ تا ضخامت 7/1 ميلي متر ، حاصل آيد. سپس ، نمونه ها در معرض فشار بالاي گاز 2PSI( CO800) به مدت 48 ساعت ، قرار داده شد ؛ تا پليمر با گاز ، اشباع شود. آنگاه با كاهش فشار گاز به فشار محيط ، يك پايداري ترموديناميك ، حاصل شد كه منجر به جوانه زني و رشد حفره هاي 2CO ، درون د
جهت ساخت داربست از روش SC/PL ، ابتدا PLGA در حلال متيلن كلرايد با 10 درصد غلظت (w/v)، حل شده و NaCl و HA به محلول PLGA در همان اندازه ها اضافه شدند. سپس اين مخلوط در استوانه‌هاي تفلوني به قطر 5/21ميلي متر و ارتفاع 25 ميلي متر ريخته شد. پس از تبخير حلال ، داربست‌هاي كامپوزيت از قالب‌ها بيرون آورده شد و نمك با قرار گرفتن داربست‌ها در آب مقطر به مدت 48 ساعت ، حذف شد و در نهايت داربست‌هاي متخلخل PLGA/HA از روش ساخت SC/PL حاصل آمد.
مشخصات داربست‌هاي PLGA/HA
خواص مكانيكي داربست‌ها با استفاده از آزمون‌هاي فشار و كشش ، مورد ارزيابي قرار گرفت. داربست‌هاي GF/PL ، داراي خواص مكانيكي بهتري نسبت به داربست‌هاي SC/PL بودند. ميانگين مدول فشار ، براي داربست‌هاي SC/PL ôGF/PL به ترتيب MPa4/0+3/2 وMPa3/0+5/4 بود و ميانگين مدول كششي براي آن‌ها به ترتيب 1/0+0/2 و2/0+9/26 مگا پاسگال بود. اين داده ها ، بيانگر 99 % افزايش در مدول فشاري و %1331 افزايش در مدول كششي است كه نشان دهنده آثار مثبت فرايند توليد GF/PL ، در بهبود خواص مكانيكي داربست‌ها است.
براي تعيين اينكه آيا فرايند توليد داربست‌ها بر ميزان تماس HA با سطح داربست ، تاثير دارد يا خير ، HA را با ماده رنگي آبدوست ، مشخص كرديم و نشان داده شد كه اين تاثير در داربست‌هاي GF/PL بيش از داربست‌هاي SC/PL است (شكل 3 قسمت هاي .(A,C,D تركيب سطح داربست‌هاي كامپوزيت PLGA/HA را نيز به وسيله XPS ، بررسي كرديم. ميزان كلسيم در سطح داربست GF/PL بيش از سطح داربست SC/PL بود(شكل3 - قسمت .(G
كشت استئوبلاست‌ها روي داربست‌ها
علاوه بر كشت سلولي در آزمايشگاه ، داربست‌ها در بدن موجود زنده (موش آزمايشگاهي) نيز قرار گرفتند. هر دو داربست كامپوزيت PLGA/HA ، امكان چسبيدن و تكثير طي يك دوره 56 روزه كشت آزمايشگاهي را از خود نشان دادند. تراكم اوليه 106x2 سلول در هر داربست ، منجر به 106x33/1 سلول در هر داربست شد كه به داربست GF/PL پس از گذشت يك روز از كشت ، چسبيبده بود كه ميزان 5/66% را نشان مي دهد. براي داربست SC/PL ، كارايي مذكور 62 درصد بود. رشد سلول‌هاي استخواني (استئوبلاست‌ها) در داربست‌هاي GF/PL ، سريع‌تر از داربست‌هاي SC/PL بود (شكل4.) ميانگين دانسيته سلول داربست‌هاي GF/PL ، برابر106x48/2 سلول در هر داربست ، پس از گذشت 4 هفته از كشت بود ؛ درحالي‌كه براي داربست‌هاي SC/PL ، برابر 106x19/2 سلول در هر داربست بود ؛ يعني به ترتيب 5/86 % و 7/69% رشد را نشان دادند (شكل5.)
بررسي كاشت در بدن موجود زنده
كاش
8هفته پس از كاشت ، رشد سلول‌هاي استخواني افزايش يافت (شكل7 قسمت .)C,F تجزيه وتحليل بافت شناسي مقاطع مياني بافت‌ها ، نشانگر تشكيل سلول‌هاي استخواني بيشتر در داربست‌هاي GF/PL ، نسبت به داربست‌هاي SC/PL و داربست‌هاي PLGA بدون HA ، پس از گذشت 5 و 8 هفته از كاشت بود (شكل8 - قسمت .(A برعكس ، داربست‌هاي PLGA بدون HA ، هيچ سلول استخواني جد
بحث و نتيجه‌گيري
دو روش (SC/PL) Solvent casting / Particulate leaching ، (GF/PL) Gas foaming / Particulateleaching ، جهت ساخت داربست‌هاي كامپوزيتي بيوسراميك/ پليمري ، جهت مهندسي بافت استخوان ، مورد بررسي قرار گرفت. داربست‌هاي PLGA/HA كه توسط روش GF/PL ساخته شدند، باعث تماس بالاي HA روي سطح داربست شده و ايجاد و رشد سلول‌هاي استخواني در آن‌ها ، نسبت به روش SC/PL ، بهتر بود. در مقايسه با ساير روش‌هاي ساخت داربست‌هاي كامپوزيتي پليمري/ سراميكي ، روش GF/PL داراي مزاياي زيادي است كه در ادامه بيان مي‌شود :
2) روش GF/PL مي تواند به طور مؤثري بيو‌سراميك‌ها را در تماس با سطح داربست‌هاي كامپوزيت پليمري/ بيوسراميكي قراردهد. اين موضوع را مي توان با آناليز XPS و استفاده از مواد رنگي آبدوست ، بررسي كرد. روش SC/PL ، منجر به پوشش داده شدن پليمر ، روي بيو‌سراميك‌ها مي‌شود كه اين امر موجب مي شود كه بيو سراميك‌ها ، تماسي با سطوح داربست ، پيدا نكنند ؛ درحالي‌كه در روش GF/PL كه از محلول پليمري استفاده نمي‌شود ، اين تماس ، بسيار خوب برقرار مي‌شود. بنابراين داربست GF/PL ، تماس سلول‌هاي استخواني را با سراميك‌هاي زيست فعال كه باعث رشد سلول‌هاي استخواني مي شود ، بيشتر مي كند.
3) داربست‌هاي GF/PL ، خواص مكانيكي بهتري نسبت به داربست‌هاي SC/PL ، دارا هستند.
استفاده از داربست‌هاي GF/PL ، منجر به بهبود پتانسيل سلول‌هاي استخواني مي‌شود. چون داربست‌هاي SC/PL و GF/PL ، داراي خواص فيزيكي مشابهي از نظر اندازه تخلخل و به هم پيوستگي تخلخل‌ها هستند، تفاوت در ميزان ايجاد و رشد سلول هاي استخواني در آن‌ها مي تواند ناشي تماس مستقيم سلول‌ها با ذرات HA روي سطح داربست باشد كه تكثير و رشد سلول‌هاي استخواني را تحريك مي كند. برعكس ذرات HA در داربست‌هاي SC/PL ، توسط پليمر پوشش داده مي شوند و تماسي با سلول ندارند و تخريب PLGA نياز به زمان طولاني داشته و هيچ شتابي در ساخت سلول‌هاي استخواني توسط HA ، ديده نمي‌شود.