شناسایی ایزوزایم ها درگیاهان

[* ziba *]

مقدمه :

اصطلاح ایزوزایم نخستین باردر سال 1959 توسط مارکر و مولر ( Marker and Moller ) برای توصیف شکل های مولکولی چندگانه یک آنزیم که از نظر ویژگی های سوبسترا یکسانند و در ارگانیسم های مشابه یافت می شوند ، استفاده شد . در یک ارگانیسم ، تکامل مورفولوژیکی و تخصصی شدن عملکرد سلول ها از راه فرایند تمایز سلولی انجام می گیرد . در طی فرایند تمایز سلولی ، آنزیم ها و پروتئین های ساختمانی متعددی ، ساخته یا تجزیه می شوند . ساخته شدن یا تجزیه آنزیم ها از نظر کمی و کیفی بسیار متنوع است و این تنوع برای بررسی تغییرات اساسی صورت گرفته در جریان فرایند تمایز شاخص مهمی به شمار می رود . از آنزیم هایی که دارای شکل های مولکولی چند گانه اند ( Isozymes ) ، می توان برای مطالعه ی مراحل مختلف فرایند تکامل سلولی در یک ارگانیسم استفاده کرد . ایزوزایم ها را می توان به دو گروه دسته بندی کرد :

1 . آنزیم هایی که از نظر ساختار مولکولی به طور کامل متفاوتند و به شکل موقت ( Permeably ) از سایت های متفاوت ژنتیکی تولید می شوند .

2 . آنزیم هایی که در اثر تغییرات ثانویه در ساختار یک گونه ی منفرد پلی پپتید ایجاد شده و در بسیاری مواقع به شکل مصنوعی در شرایط درون لوله آزمایش ( Invitro ) ساخته می شوند . شکل های چند گانه در یک آنزیم به دلایل مختلفی چون عوامل ژنتیکی و یا تأثیر عوامل فیزیکی و شیمیایی محیطی ، به وجود می آیند . یکی از ساز و کار های ژنتیکی که موجب به وجود آمدن ایزوزایم ها می شود ، می توان مضاعف شدن ژن ( Duplication ) و در پی آن ایجاد موتاسیون در لوسی ( Loci ) مادری و دختری دانست .از این رو به نظر می رسد که بیش از یک ژن در ایجاد آنزیم هایی که دارای چند زیر شاخه اند ، نقش داشته باشند . افزون بر این ، درصورتی که امکان شکل گرفتن چند مولتی مر وجود داشته باشد ، وجود تنها دو ژن برای تولید شکل های مختلف ایزوزیم کافی خواهد بود . دیگر دلایل احتمالی تشکیل ایزوزایم ها عبارتند از :

1 . اتصال یک پلی پپتید منفرد به انواع مختلف مولکول های کوانزیم یا دیگر گروه های پروستتیک ؛

2 . به دلیل ایجاد تغییراتی در ساختمان های سه تایی یا چهارتایی یک پپتید اولیه ؛

3 . در طی مرحله ی تهیه یا ذخیره سازی .

 

[* ziba *]

انتخاب بافت :

آنزیم ها را می توان از طیف وسیعی از بافت های گیاهی استخراج کرد . آنزیم ها را اغلب از بافت های رویشی مانند : پهنک و دمبرگ برگ ، ساقه های آب دار ، قسمت انتهایی ریشه و ... تهیه می کنند . در بعضی مواقع برای این کار می توان از گیاهچه های جوان نیز استفاده کرد . همچنین از بعضی قمت های بذر مانند جنین ، آندوسپرم ، لپه هایی که آب جذب کرده اند و هیپوکوتیل نیز می توان استفاده کرد . در اغلب موارد دلیل استفاده از گیاهچه ها یا برگ های جوان که از نظر متابولیکی فعال هستند ، این است که این قسمت ها دارای بیشترین فعالیت آنزیمی اند . دانه ی گرده نیز یکی از منابع غنی آنزیم ها بوده و افزون بر این به دلیل آسان بودن عصاره گیری از آن و نیز کمک به تفسیر ژنتیکی از راه مقایسه ی آن با سلولهای سوماتیکی دیپلوئید ، به این منظور مورد استفاده قرار می گیرند . در برخی موارد خاص ، برای این کار می توان از میوه ها ، دانه های تک گرده یا نمونه های علفی نیز استفاده کرد .

توجه :

صرف نظر از نوع بافت مورد نظر ، در زمان نمونه گیری باید دقت کرد که نمونه های تهیه شده از نظر فیزیولوژیکی و رشد و نمو ، دارای وضعیت مشابهی باشند .

 

[* ziba *]

روش عصاره گیری :

در بیشتر موارد ، نمونه ی بافتی که برای آزمایش انتخاب می شود ، ابتدا باید به یک عصاره ی خام بافر شده ( Crude Buffered Extracts ) تبدیل شود . البته برای این کار نیازی به طی مراحل پیچیده ی خالص سازی پروتئین یا فرایند تغلیظ نیست .

بافت های فوم مانند بذرهایی که آب جذب کرده اند یا بافت های رویشی آبدار را به همراه یک بافر مناسب در یک هاون سرد قرار می دهند .و به خوبی می کوبند . از روش هایی مانند آسیاب کردن نمونه ها در نیتروژن مایع با استفاده از دستگاه های همزن قوی ، برای عصاره گیری از برگ یا برگ های سوزنی مانند برگ کاج استفاده می شود .

هدف اصلی از کوبیدن و له کردن نمونه ها ، ایجاد خسارت و تخریب کامل سلول های برگ بدون استفاده از حرارت است . نوع بافری که در زمان کوبیدن سلول ها استفاده می شود نیز اهمیت بسیاری دارد . چنانچه نمونه های گیاهی عاری از فنل و دیگر عوامل شیمیایی مزاحم باشد ، بهتر این است که در زمان تهیه ی ترکیب ، از یک بافر به نسبت ساده استفاده شود .

اما بسیاری از بافت های گیاه ، دارای مقادیر زیادی فنل می باشند که با آنزیم های گیاهی ترکیب شده و موجب بروز اختلال های سلولی می شوند . پیامد های احتمالی این مسئله کاهش فعالیت های آنزیمی و در نهایت نتایج اشتباه خواهد بود . هیچ بافر جدا کننده ای وجود ندارد که قادر باشد به تنهایی در برابر چنین آثاری ، به شکل مؤثر از آنزیم ها حفاظت کند .

محقان با آزمون های بسیار موفق به تهیه و تولید تعداد بسیار زیادی بافر شده اند که در فرایند جداسازی و عصاره گیری از کارایی مطلوبی برخوردارند . البته بسیاری از این بافرها شبیه به هم هستند و تنها در برخی جزئیات با یکدیگر تفاوت دارند . به منظور جداسازی آنزیم ها ، نمونه های گیاهی با وزن 0/5 گرم را به همراه 750 میکرو لیتر بافر جدا کننده ، به طور کامل بکوبید و له کنید ( در زیر هاون مورد استفاده مقداری یخ قرار دهید تا هاون به طور کامل سرد شود ) ، سپس عصاره ی حاصل را به مدت 20 دقیقه در دمای 45 درجه سانتی گراد با سرعت 20 هزار دور در دقیقه سانتریفوژ کرده و بعد تعلیق حاصل را الکتروفورز کنید .